童傳旺

（蕪湖職業(yè)技術(shù)學院，安徽蕪湖241000）

在正常衰老過程中，視覺能力會出現(xiàn)進行性衰退，表現(xiàn)為視覺對比敏銳度下降、視銳度減弱、對物體朝向和運動方向辨別能力的障礙以及對視覺信息分析速度減慢等[1-2]，有關老年性視覺功能衰退的神經(jīng)機制尚處于探索階段[3]。一方面，老年性視覺功能衰退主要與視覺通路中哪些層次的神經(jīng)可塑性變化有關仍處于爭論之中[1，2，4-5]。盡管一些電生理研究結(jié)果顯示，外膝體（lateral geniculate nucleus，LGN）神經(jīng)元對視覺刺激的反應特性沒有明顯的年齡相關性變化，衰老可能主要影響視覺皮層特別是高級視覺皮層神經(jīng)元的功能[1，4-6]，但這并不能排除衰老過程中LGN可能發(fā)生的形態(tài)學和神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的改變[7]，這些改變可通過突觸聯(lián)系影響視皮層對視覺刺激的反應特性。另一方面，老化引起視覺中樞神經(jīng)元功能衰退的細胞分子機制尚不清楚。最近的研究結(jié)果顯示，衰老伴隨著視覺中樞內(nèi)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)（如GABA）表達減少[8]，神經(jīng)抑制作用減弱，這可能是導致視覺皮層神經(jīng)元對視覺刺激反應的敏感性和選擇性下降的重要原因[9]，然而，引起抑制性神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)活動降低的信號傳遞和分子機制卻知之甚少。

近些年對神經(jīng)營養(yǎng)因子的研究發(fā)現(xiàn)，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）通過其受體介導的信號轉(zhuǎn)導在神經(jīng)元的發(fā)育、存活、損傷修復和神經(jīng)可塑性等方面發(fā)揮著重要作用[10-12]。有報道顯示，BDNF信號系統(tǒng)可參與皮層內(nèi)活動依賴的抑制行調(diào)節(jié)，并促進GABA的合成和運輸[13-15]。是否因衰老過程中BDNF及其受體表達下降，從而引起抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA分泌減少？目前尚無充足的試驗證據(jù)，盡管有少數(shù)研究報道顯示，腦內(nèi)BDNF及其受體的表達出現(xiàn)了年齡相關性變化[16]。

貓作為研究視覺系統(tǒng)功能的模型動物，因其視覺系統(tǒng)進化較為高級且視覺組織結(jié)構(gòu)與系統(tǒng)功能與人類較為相似。本研究選取外膝體作為視覺功能研究層次，基于外膝體在第一視覺通路中具有視覺信息初級整合編碼的“中繼站”作用，希望通過對外膝體開展相關研究，揭示外膝體水平上的有關視覺通路相關調(diào)節(jié)機制的研究資料。我們以前的研究發(fā)現(xiàn)，貓外膝體（LGN）內(nèi)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA的表達增齡性顯著降低[17]，這是否與BDNF及其受體的表達下調(diào)有關尚不清楚。為進一步探討該問題，本研究以青、老年貓為研究對象，采用免疫組織化學方法研究外膝體中BDNF及其高親和力的酪氨酸激酶B受體（tyrosine kinase receptor，TrkB）表達以及低親和力受體蛋白（P75NTR）的年齡差異，為視覺功能衰老的細胞、分子機理的研究提供思路。

1 材料和方法

1.1 試劑材料及試驗動物

本研究選取2.0～3.5 kg體重貓為試驗對象，試驗前對試驗對象行眼部疾病檢查確保其視覺功能正常而消除干擾。選定青年組貓（1-3齡）與老年組（10-13齡）各4只進行試驗編組。施行鹽酸氯胺酮注射麻醉達足夠深度后（鹽酸氯胺酮按體重40 mg/kg計），立即采取開胸操作，并向心臟內(nèi)灌注生理鹽水（0.9%），待肝臟發(fā)白后灌注預固定液（戊二醛2.5%+福爾馬林10%+磷酸緩沖液pH7.2～7.4，0.1 mol/L，按體重200 mL/kg計）。開顱操作切取腦干部分繼續(xù)固定2 h。切取外膝體靜置于固定液（戊二醛2.5%+福爾馬林10%+蔗糖30%），直至腦組織塊完全固定沉入底部。制作厚20μm冰凍冠狀連續(xù)切片，隔5取4法選取切片編組（單只貓抽取10組），每組4片切片對應BDNF、TrkB、P75NTR免疫染色組及空白對照組。

1.2 免疫組織化學染色

室溫下滴注3% H2O2孵育、滅活內(nèi)源性過氧化物酶冰凍切片15 min；純水淋洗后，室溫下滴注PBS溶液（含TritonX-100：0.3%）孵育20 min；室溫下滴注小牛血清蛋白（5%）至完全封覆特異反應部位孵育20 min；傾盡血清，滴注經(jīng)1∶100稀釋的一抗（分別為兔抗鼠BDNF及兔抗人TrkB、P75NTR多克隆抗體稀釋液）4℃恒溫孵育36 h；以PBS淋洗（5 min為1次，連續(xù)3次）；滴注二抗（羊抗兔IgG工作液）進行反應標記，室溫下孵育20 min；以PBS淋洗（5 min為1次，連續(xù)3次）；滴注三抗SABC（鏈霉素過氧化物酶），室溫下孵育20 min；以PBS淋洗（5 min為1次，連續(xù)3次）；DAB染色顯色，切片經(jīng)常規(guī)梯度濃度酒精脫水操作后，二甲苯透明，中性樹膠封片并作鏡下檢查?？瞻讓φ涨衅M，一抗代之以PBS液，余同處理。試驗試劑盒、DAB購自博士德生物公司。

1.3 觀察記錄形態(tài)學數(shù)據(jù)及分析處理

隨機抽取青年、老年組中BDNF、TrkB、P75NTR各20片染色切片進行顯微觀察，并采集形態(tài)信息。觀察用顯微鏡型號為Olympus BX-51，圖像采集、分析信息軟件采用Image Pro Express 6.0軟件完成。主要觀察及采集信息指標包括：BDNF、TrkB、P75NTR免疫陽性細胞在貓外膝體各層的表達情況，以及免疫陽性反應強度（以光吸收度均值IOD為參照，反應強度越高，IOD值越大）。

低倍鏡下（40×）分別獲取BDNF、TrkB、P75NTR染色切片圖像，較高倍鏡下（100×）確定外膝體A、A1、C層結(jié)構(gòu)，再至高倍鏡（400×）下觀察計數(shù)。以“50μm×50μm”標尺確定視野大小規(guī)格，各層視野數(shù)隨機選定10個。各視野內(nèi)統(tǒng)計BDNF、TrkB、P75NTR免疫陽性細胞數(shù)，染色細胞胞體含有明顯的免疫陽性物質(zhì)且具有細胞核為識別計數(shù)標準。經(jīng)各視野內(nèi)統(tǒng)計BDNF、TrkB、P75NTR免疫陽性細胞數(shù)，多次觀察值取均值后結(jié)合視野大小轉(zhuǎn)換為細胞密度（cells/mm2）記錄。免疫陽性反應強度IOD值測量以圖像采集軟件對切片隨機選取視野（每張切片20個）測量記錄。采集數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”（mean±SD）形式記錄。分析統(tǒng)計由SPSS 13.0軟件進行，統(tǒng)計方法為ANOVA顯著性檢驗及相關性檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 BDNF及TrkB、P75NTR陽性細胞形態(tài)學信息統(tǒng)計分析

切片觀察發(fā)現(xiàn)，貓外膝體中各層中BDNF及TrkB、P75NTR陽性細胞及纖維均有分布，胞體多呈棕黃或黃褐色。低倍鏡下可見外膝體A、A1層免疫陽性細胞分布較C層密集。高倍鏡下可見著色較深的呈卵圓形或不規(guī)則形陽性細胞胞體，且陽性細胞的突起結(jié)構(gòu)（神經(jīng)元軸、樹突及膠質(zhì)細胞突起）中亦可見免疫陽性物質(zhì)分布（見圖1）。

圖1 貓外膝體A層中免疫陽性細胞（箭頭指及）及纖維Figure 1 Show immunoreactive cells(arrows)and fibers in the LGN(lamina A)of cats

青年、老年組內(nèi)外膝體不同層次間數(shù)據(jù)比較檢驗結(jié)果顯示，在青年、老年組貓外膝體中，BDNF陽性細胞的密度表現(xiàn)為A層和A1層分別較C層高[F（1，158）=27.12，P＜0.01；F（1，158）=40.06，P＜0.01]，A層 與A1層相比無顯著差異[F（1，158）=1.33，P=0.25]。青年、老年組間數(shù)據(jù)比較結(jié)果顯示，老年貓外膝體中BDNF免疫陽性細胞密度較青年貓顯著降低[F（1，158）=125.39，P＜0.01]，且各年齡組內(nèi)個體間無顯著差異[F（3，236）=1.11，P=0.35]。青年、老年組內(nèi)外膝體A層和A1層中的TrkB及P75NTR陽性細胞密度亦較C層的高[TrkB組：F（1，158）=28.16，P＜0.01；F（1，158）=29.92，P＜0.01。P75NTR組：F（1，158）=44.14，P＜0.01；F（1，158）=33.13，P＜0.01]，A層與A1層相比無顯著差異[TrkB組：F（1，158）=0.02，P=0.89。P75NTR組：F（1，158）=1.23，P=0.14]。青年、老年組間數(shù)據(jù)比較結(jié)果顯示，老年組TrkB及P75NTR免疫陽性細胞密度均較青年貓的顯著減小[TrkB組：F（1，158）=208.54，P＜0.01。P75NTR組：F（1，158）=320.58，P＜0.01]，且各年齡組內(nèi)個體間無顯著差異[TrkB組：F（3，236）=0.22，P=0.88。P75NTR組：F（3，236）=0.94，P=0.25]（見表1）。

數(shù)據(jù)相關性檢測分析結(jié)果提示：貓外膝體BDNF及TrkB、P75NTR免疫陽性細胞密度變化之間呈現(xiàn)顯著相關性（BDNF與TrkB相關系數(shù)r=0.87，P＜0.01；BDNF與P75NTR相關系數(shù)r=0.57，P＜0.01；TrkB與P75NTR相關系數(shù)r=0.61，P＜0.01）。

2.2 BDNF及TrkB、P75NTR受體免疫陽性反應強度

數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示：與青年組相比，老年組貓外膝體中BDNF陽性反應強度值顯著減小[F（1，78）=18.74，P＜0.01]，其中A、A1和C層分別下降幅度為26.4%、20.3%和36.3%。老年組TrkB陽性反應強度比青年組顯著減小[F（1，78）=28.46，P＜0.01]，其中A、A1和C層分別下降幅度為25.6%、26.5%和35.3%。老年組P75NTR陽性反應強度比青年組亦顯著減小[F（1，78）=39.72，P＜0.01]，其中A、A1和C層分別下降幅度為21.3%、18.5%和32.1%（見圖2）。

表1 青年組及老年組貓外膝體中BDNF及TrkB、P75NTR免疫陽性細胞密度比較（mean SD）Table 1 A comparison on density of BDNF-IR and TrkB-IR，P75NTR-IR cells in the LGN of young and old cats(mean SD) cells/mm2

3 討論與結(jié)論

高等動物主要依靠視覺功能獲得外部信息，衰老引起的視覺功能減退會直接影響生活的質(zhì)量。探討老年性視覺能力下降的神經(jīng)網(wǎng)絡和細胞分子機制，有利于通過醫(yī)學途徑延緩衰老對視覺的影響，提高老年人的視覺能力[18]。

在人和高等動物中，視覺信息的加工分視網(wǎng)膜、外膝體和視皮層3個由低到高的層次。近些年的電生理研究結(jié)果顯示，衰老可能主要改變了視皮層神經(jīng)元對視覺刺激的反應特性，包括對刺激的方位和運動方向選擇性、對比度敏感性以及空間和時間頻率的選擇性等[19-21]，而衰老對外膝體神經(jīng)元反應特性的影響似乎并不明顯[22]。盡管如此，我們并不能排除外膝體在細胞和分子水平的老年性變化。之前的研究發(fā)現(xiàn)老年貓外膝體中抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA的表達比青年貓的顯著減少[17]。神經(jīng)遞質(zhì)GABA的表達減少可能因為下行通路或其他因素的補償作為而沒有在功能水平表現(xiàn)出來。因此，衰老對外膝體的影響主要表現(xiàn)在細胞水平。

圖2 貓外膝體中BDNF、TrkB及P75NTR免疫陽性反應的平均光吸收IOD值Figure 2 Show the mean IOD(Integrated optical density)value of BDNF and TrkB，P75NTR immunoreactivity in the LGN of cats

近些年對神經(jīng)營養(yǎng)因子的研究結(jié)果顯示，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF通過其受體介導的信號轉(zhuǎn)導，對神經(jīng)元的發(fā)育、存活及突觸可塑性等具有重要作用[23]。BDNF受體主要包括高親和力的受體Trk和低親和力的P75NTR受體，其中Trk類受體與BDNF特異性結(jié)合直接發(fā)揮特定功能，而低親和力受體P75NTR雖可與各類神經(jīng)營養(yǎng)因子廣泛結(jié)合，其并非為神經(jīng)營養(yǎng)因子發(fā)揮功能的必需因子。一般認為P75NTR主要為增強高親和力受體TrkB與BDNF高親和結(jié)合位點的形成過程，并增強TrkB受體表達的時階特異性與組織特異性[24]。有相關研究證實,BDNF參與的信號轉(zhuǎn)導對于GABA能神經(jīng)元的發(fā)育、存活和功能表達具有重要的支持作用[25-27]，并可能直接參與腦內(nèi)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA的合成和轉(zhuǎn)運[13-14]。是否老年動物外膝體中GABA表達的下降與BDNF信號轉(zhuǎn)導作用異常引起的，目前尚缺乏充足的試驗證據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，老年貓和青年組貓外膝體各層神經(jīng)元密度沒有顯著差異，表明在衰老過程中外膝體神經(jīng)元的數(shù)量維持相對穩(wěn)定，這與以前的研究報道結(jié)果一致[17]。然而，老年貓外膝體各層中BDNF和TrkB、P75NTR免疫陽性細胞密度比青年貓的顯著下降，且BDNF和TrkB、P75NTR的免疫陽性反應強度亦明顯減弱。這一結(jié)果提示老年組貓中神經(jīng)元的絕對數(shù)量并未發(fā)生顯著減少，而BDNF和TrkB、P75NTR相關的特異神經(jīng)元陽性反應呈現(xiàn)出的在數(shù)量和強度上的顯著減弱提示老年個體BDNF-TrkB調(diào)節(jié)功能呈現(xiàn)下降趨勢。類似的結(jié)果也在視覺高級結(jié)構(gòu)初級視皮層BDNF年齡相關性表達變化研究中亦有報告[28]。阿爾茨海默癥（Alzheimer disease，AD）患者及老齡大鼠的海馬中也曾報道過較一致的觀察結(jié)果[16，29-30]，表明在衰老過程中BDNF與TrkB、P75NTR的表達減少，BDNF-TrkB信號轉(zhuǎn)導活動降低。

總之，本研究結(jié)果表明，衰老會引起外膝體各層中BDNF與TrkB、P75NTR受體的表達下調(diào)，P75NTR介導的BDNF-TrkB結(jié)合過程的活化減弱，BDNF-TrkB信號轉(zhuǎn)導活動減弱可能導致GABA表達下降，這些抑制性神經(jīng)末梢通過突觸前和突觸后抑制作用的減弱可能亦會影響視皮層神經(jīng)元對視覺刺激反應的選擇性和敏感性，從而引起老年性視覺能力減退。