姚攀鋒，呂兵兵，李 琪，董玘鑫，王安虎，吳 琦*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 雅安625014；2.西昌學(xué)院，四川 西昌615000）

苦蕎（Fagopyrum tataricum）屬于蓼科蕎麥屬一年生草本植物，由于其富含蘆丁、花青素等黃酮類化合物，因此，對(duì)人體具有降“三高”等多種保健功能[1]。與此同時(shí)，黃酮類化合物也有助于提高植物對(duì)逆境的耐受力，植物會(huì)通過調(diào)控黃酮化合物合成相關(guān)基因的表達(dá)對(duì)環(huán)境刺激迫作出響應(yīng)，由此形成一種自我保護(hù)機(jī)制[2]。研究表明，苦蕎黃酮中的花青素含量上升常常伴隨著逆境的出現(xiàn)，參與抵抗紫外輻射、抗寒和抗旱等多個(gè)生理過程。Li S.等[3]對(duì)芽期苦蕎子葉和胚軸分別進(jìn)行了低溫脅迫后發(fā)現(xiàn)，處理后苦蕎子葉和胚軸中花青素含量均顯著提高。此外，苦蕎冷處理后的轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析顯示，4℃脅迫之后苦蕎的矢車菊素3-0-葡萄糖苷和矢車菊素3-0-蕓香糖苷相比正常條件下分別提高了6.3和11.3倍[4]。因此，花青素作為苦蕎體內(nèi)一類重要的黃酮類化合物，在苦蕎的抗逆機(jī)制中起著重要的作用。

花青素生物合成途徑是類黃酮物質(zhì)合成途徑的一個(gè)分支，參與其生物合成相關(guān)的基因主要包括結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子這兩大類，二者共同調(diào)控植物花青素的代謝合成[5]。參與花青素支路調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子眾多，主要包括MYB、bHLH和WD40等，它們單獨(dú)或者形成復(fù)合物發(fā)揮生物學(xué)作用[5]。其中，bHLH轉(zhuǎn)錄因子是植物中僅次于MYB轉(zhuǎn)錄因子的第二大轉(zhuǎn)錄因子超家族廣泛存在于植物中，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育與形態(tài)建成、次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成及對(duì)外界環(huán)境脅迫應(yīng)答中起著重要的調(diào)控作用[5-6]。例如，在番茄中持續(xù)表達(dá)ZmLc、Delila和MYC-RP/GP等bHLH類蛋白，能使花青素在地上部分(包括果實(shí))和根中大量積累[7]。過表達(dá)Delila（bHLH）基因，在果實(shí)中特異的啟動(dòng)子E8的控制下，能導(dǎo)致花青素在果肉和果皮中強(qiáng)烈的增加，果實(shí)呈暗紫色[5]。可見，bHLH轉(zhuǎn)基因能激活花青素代謝途徑中一系列結(jié)構(gòu)基因，促進(jìn)花青素等黃酮物質(zhì)在植物中的大量積累，較單個(gè)結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)基因具有更為廣泛的作用。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)獲得的苦蕎花期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，采用RT-PCR技術(shù)克隆出一條與花青素調(diào)控相關(guān)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子MYC亞家族的基因FtMYC，并采用UV-B、4℃冷脅迫處理二葉期苦蕎，探究FtMYC基因在非生物脅迫條件下的表達(dá)量變化與花青素含量的相關(guān)性，并分析了FtMYC基因啟動(dòng)子上的主要順式作用元件，初步明晰FtMYC的結(jié)構(gòu)及其在苦蕎逆境脅迫中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料及主要試劑

苦蕎“西蕎2號(hào)”由西昌學(xué)院王安虎教授惠贈(zèng)，栽培在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院人工氣候室；植物RNAout（Trizol法）試劑盒、TaqDNA聚合酶、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、SYBR Premix ExTaqTMII（Perfect Real Time）購(gòu)自TaKaRa公司，其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 苦蕎FtMYC基因的克隆

采用SDS法提取苦蕎葉片總DNA，采用植物RNAout試劑盒參照說明書提取苦蕎總RNA，并反轉(zhuǎn)錄制備cDNA第一條鏈。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的苦蕎花期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物分別以苦蕎總DNA和cDNA第一鏈為模板擴(kuò)增FtMYCDNA和cDNA序列，引物序列：FtMYCf（5'-ATGCAGGCAAATCTC AGAGAAC-3'）和FtMYCr（5'-TCACCCACATTTCG TTATAGCT-3'）。將PCR產(chǎn)物亞克隆至T載體，送擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.2 苦蕎FtMYC基因的生物信息學(xué)分析

通過NCBI在線工具Blast對(duì)FtMYC氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)；通過DNAMAN軟件FtMYC及其它同源蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)，分析它的保守結(jié)構(gòu)域；通過MEGA 5.0軟件，根據(jù)鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建FtMYC的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.3 二葉期苦蕎的脅迫處理

UV-B處理：使用10W UV-B（308 nm）LED燈照射二葉期苦蕎，光照距離30 cm；4℃冷處理：在光照條件為16 h/8 h(光照/黑暗)、4℃的培養(yǎng)箱對(duì)子葉期的苦蕎進(jìn)行冷處理。以上處理均在處理前0 h、處理后1、3、6、12、24和48 h分別取樣品的胚軸和子葉液氮速凍后放在-80℃超低溫冰箱保存。

1.2.4 苦蕎FtMYC基因表達(dá)量的檢測(cè)

根據(jù)FtMYC基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)熒光定量PCR引物：qFtMYCf（5'-AAT GCG AAT CAG GCG GAC A-3'）和qFtMYCr（5'-GGC ACC CAA CTC GACA ACA C-3'）。以苦蕎FtH3基因?yàn)閮?nèi)參基因，其引物為：qFtH3f（5'-GAA ATT CGC AAG TAC CAG AAG AG-3'）和qFtH3r（5'-CCA ACA AGG TAT GCC TCA GC-3'）。以cDNA為模板，采用SYBR Premix ExTaqTMII（Perfect Real Time）試劑盒檢測(cè)FtMYC基因在不同條件處理下的表達(dá)水平，通過2-ΔΔCt方法來計(jì)算它的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 苦蕎花青素的提取及定量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取0.2 g新鮮樣品用液氮研磨后加入1 mL 1%鹽酸的甲醇提取液在25℃、100 r/min條件下震蕩浸提18 h；3 080 r/min離心15 min后取500μL上清，并加入等體積的雙蒸水和300μL氯仿混勻；2 268 r/min離心5 min后取上清，即為花青素提取液。最后通過紫外分光光度計(jì)檢測(cè)530 nm和657 nm處的吸光值。采用如下公式計(jì)算花青素的量：花青素（mg/g）=（A530-0.25×A657）/鮮質(zhì)量。

1.2.6 苦蕎FtMYC基因啟動(dòng)子克隆及的生物信息學(xué)分析

根據(jù)苦蕎基因組數(shù)據(jù)（http：//gsa.big.ac.cn/index.jsp），設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物PFtMYCf（5'-CGG GAA TAT AAT GAT TCG AGA CAA-3'）和PFtMYCr（5'-CAT TAT GCT TTG ACA AGC AAG C-3'），以苦蕎DNA為模板擴(kuò)增FtMYC基因啟動(dòng)子序列，PCR產(chǎn)物亞克隆至T載體后，送擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。通過Plant CARE數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）和PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)基因5’側(cè)翼序列所含元件進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，利用啟動(dòng)子核心分析數(shù)據(jù)庫(kù)BDGP（http：//www.fruitfly.org/seq-tools/promoter.html）對(duì)FtMYC基因啟動(dòng)子的核心元件進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)的分析和處理

采用IBM SPASS Statistics 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)苦蕎FtMYC基因的表達(dá)量與各樣本花青素的量進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 FtMYC基因cDNA序列的克隆

分別以苦蕎cDNA和總DNA為模版擴(kuò)增得到2條大小約為1 300 bp的特異條帶，見圖1。測(cè)序結(jié)果顯示該基因的cDNA和DNA片段分別為1 287和1 309 bp。根據(jù)已獲得的苦蕎FtMYC基因的cDNA和DNA序列，利用DNAMAN軟件比對(duì)確定其全長(zhǎng)DNA序列為1 309 bp，有1個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成（見圖2），符合標(biāo)準(zhǔn)的GT-AG剪切原則。Blastp比對(duì)結(jié)果表明，苦蕎FtMYC基因?qū)儆赽HLH-MYC亞家族。選取bHLH家族中擬南芥AtGL3、葡萄VvMYCA1、紫蘇PfMYC-RP和金魚草AmDELILA進(jìn)行多重序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)苦蕎FtMYC在N-端包含一個(gè)由191個(gè)氨基酸組成的bHLH-MYC-N結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域?qū)儆赽HLH轉(zhuǎn)錄因子家族中MYC蛋白的特殊結(jié)構(gòu)域[8]，見圖3。在C-端的bHLH結(jié)構(gòu)域處也具有較高的保守性。以上結(jié)果表明，本文獲得的FtMYC基因?qū)儆赽HLH轉(zhuǎn)錄因子中的MYC亞家族，其在GenBank中的登錄號(hào)為：KU162971。

圖1 苦蕎FtMYC基因cDNA和啟動(dòng)子的擴(kuò)增Figure 1 Amplification of FtMYC and promoter from tartary buckwheat

圖2 苦蕎FtMYC基因結(jié)構(gòu)示意圖Figure 2 Structure diagram of FtMYC

圖3 不同植物bHLH氨基酸序列比對(duì)Figure 3 Alignment of amino acid sequences of bHLH from different plants

2.2 苦蕎FtMYC系統(tǒng)進(jìn)化分析

采用MEGA 5.0鄰接法構(gòu)建基于FtMYC氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（見圖4）。選擇均已有功能相關(guān)性研究的植物MYC蛋白序列，結(jié)合M.Heim等[9]根據(jù)bHLH保守域氨基酸組成特點(diǎn)對(duì)擬南芥133個(gè)bHLH蛋白的結(jié)構(gòu)解析及分類，初步分析苦蕎該FtMYC可能具有的功能。圖4中的進(jìn)化樹分析表明，這些MYC蛋白可明顯分為4個(gè)大簇，由于這4簇之間氨基酸序列間差異較大，推測(cè)其具有不同的進(jìn)化模式，表現(xiàn)出功能分化。苦蕎（Fagopyrum tataricum）FtMYC與擬南芥（Arabidopsis thaliana）AtGL3、葡萄（Vitis vinifera）VvMYCA1、紫蘇（Perilla frutescens）PfMYC-RP和金魚草（Antirrhinum majus）AmDELILA歸于一簇，而這些蛋白均參與花青素代謝的有關(guān)調(diào)控，推測(cè)苦蕎FtMYC具有相似的功能。

2.3 非生物逆境脅迫下苦蕎FtMYC的表達(dá)與花青素含量分析

2.3.1 UV-B對(duì)苦蕎FtMYC表達(dá)和花青素含量的影響

使用熒光定量PCR分析FtMYC在UV-B處理下芽期苦蕎的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果表明：在胚軸中，F(xiàn)tMYC的表達(dá)量從處理1 h開始上升，每隔3 h呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)，處理2 h后顯著上升（P＜0.05），為處理前（0 h）的1.83倍（見圖5）；子葉中，F(xiàn)tMYC在的表達(dá)量變化則更為明顯，處理6 h后極顯著上升（P＜0.01），為對(duì)照組的13.29倍，隨后下降，48 h后接近處理前水平（見圖6）。同時(shí)，花青素含量分析結(jié)果表明：胚軸中的花青素含量隨著處理時(shí)間不斷升高，12 h后為對(duì)照組的1.88倍并趨于穩(wěn)定（見圖5）；子葉中花青素含量的變化更為明顯，處理6 h后顯著性提高（P＜0.05），對(duì)照組的1.44倍（見圖6）。

圖4 苦蕎FtMYC與其他植物來源MYC蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 4 Phylogenetic tree based on amino acids equences of FtMYC and other plants

圖5 UV-B對(duì)苦蕎胚軸FtMYC表達(dá)量和花青素含量的影響Figure 5 Expression levels FtMYC gene and anthocyanins content in hypocotyl under UV-B treatment condition

2.3.2 冷脅迫對(duì)苦蕎FtMYC表達(dá)和花青素含量的影響

使用熒光定量PCR分析FtMYC在冷處理下芽期苦蕎的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果表明：FtMYC在胚軸中的表達(dá)量從處理1 h開始上升，但上升趨勢(shì)不明顯，12 h后達(dá)到最大為對(duì)照組的1.67倍，之后下降接近對(duì)照水平（見圖7）；而FtMYC在子葉中的表達(dá)量變化卻很明顯，1 h后就發(fā)生極顯著性變化（P＜0.01），12 h后達(dá)到對(duì)照組的15.3倍，之后降低為對(duì)照組的1.83倍（見圖8）?；ㄇ嗨睾繙y(cè)定結(jié)果顯示：在該條件下苦蕎胚軸、子葉中花青素含量的變化趨勢(shì)基本一致，均在12 h后極顯著提高（P＜0.01），分別為對(duì)照組的2.29倍和1.94倍。

圖6 UV-B對(duì)苦蕎子葉FtMYC表達(dá)量和花青素含量的影響Figure 6 Expression levels FtMYC gene and anthocyanins content in cotyledon under UV-B treatment condition

2.3.3 苦蕎FtMYC基因表達(dá)與花青素含量的相關(guān)性分析

使用IBM SPSS Statistics 20統(tǒng)計(jì)軟件分析不同脅迫條件下苦蕎胚軸和子葉中FtMYC基因的相對(duì)表達(dá)量與花青素含量的相關(guān)性（見表1）。以相關(guān)系數(shù)（r）絕對(duì)值大于0.75位閾值時(shí)，UV-B處理下FtMYC表達(dá)量與苦蕎胚軸中花青素含量變化顯著性相關(guān)（r=0.798，P＜0.05），與子葉中花青素含量變化極顯著相關(guān)（r=0.887，P＜0.01）。4℃冷處理下FtMYC表達(dá)量與苦蕎胚軸中花青素含量變化沒有明顯的相關(guān)性（r=0.744），但與子葉中花青素含量變化顯著性相關(guān)（r=0.814，P＜0.05）。結(jié)果表明，苦蕎FtMYC基因表達(dá)量與花青素含量具有較強(qiáng)的正相關(guān)。

圖7 冷脅迫對(duì)苦蕎胚軸FtMYC表達(dá)量和花青素含量的影響Figure 7 Expression levels FtMYC gene and anthocyanins content in hypocotyl under cold treatment condition

圖8 冷脅迫對(duì)苦蕎子葉FtMYC表達(dá)量和花青素含量的影響Figure 8 Expression levels FtMYC gene and anthocyanins content in cotyledon under cold treatment condition

表1 苦蕎子葉和胚軸中花青素含量與FtMYC基因表達(dá)量的相關(guān)性Table 1 Correlation coefficients between FtMYC expression levels and total anthocyanins contents in cotyledons and hypocotyl of Tartary buckwheat

2.4 FtMYC基因啟動(dòng)子元件分析

以苦蕎DNA為模版，PCR擴(kuò)增得到一條1684bp的特異條帶，見圖1。測(cè)序結(jié)果與苦蕎基因組數(shù)據(jù)完全一致，表明獲得了FtMYC基因的啟動(dòng)子序列，將其命名為pFtMYC。本研究進(jìn)一步采用DNAMAN軟件對(duì)pFtMYC的序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示：pFtMYC序列包含了63.7%的A/T堿基，符合植物啟動(dòng)子的基本特征。通過在線網(wǎng)站對(duì)該啟動(dòng)子序列的分析結(jié)果顯示，pFtMYC中包含有大量的順式作用元件，比如啟動(dòng)子核心元件、環(huán)境和激素類響應(yīng)元件等（見表2）。其中，與環(huán)境響應(yīng)相關(guān)的元件所占比例較大，例如低溫應(yīng)答元件、光響應(yīng)元件、真菌誘導(dǎo)調(diào)節(jié)元件、熱脅迫響應(yīng)元件等等。此外，pFtMYC中還存在一些其他類型的元件，如激素應(yīng)答元件、蛋白結(jié)合位點(diǎn)以及分生組織表達(dá)相關(guān)應(yīng)答元件。以上表明，多種環(huán)境因子均可調(diào)控苦蕎FtMYC基因的表達(dá)。

3 討論與結(jié)論

MYC蛋白屬于bHLH家族的轉(zhuǎn)錄因子，該類轉(zhuǎn)錄因子在動(dòng)植物體內(nèi)具有多種生物學(xué)功能。MYC蛋白的N-端含有一個(gè)bHLH-MYC-N結(jié)構(gòu)域，C-端含有一個(gè)結(jié)合目的基因啟動(dòng)子中E-box的bHLH型DNA結(jié)合域，MYC蛋白主要通過結(jié)合靶標(biāo)基因啟動(dòng)子序列中E-box元件的保守序列CAC(G/A)TG來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[8]。本研究利用苦蕎轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)成功克隆得到1個(gè)bHLH家族的轉(zhuǎn)錄因子基因FtMYC，因其編碼的氨基酸序列N-端和C-端區(qū)域分別包含有MYC轉(zhuǎn)錄因子典型的保守結(jié)構(gòu)域，這表明FtMYC屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子中MYC家族的一個(gè)成員。

植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子能夠參與調(diào)控多種生理途徑，如花器官發(fā)育、光形態(tài)建成、植物抗逆等，其中調(diào)節(jié)類黃酮和花青素合成是植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子最重要功能之一[10]。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示（見圖4），F(xiàn)tMYC和VvMYCA1等參與花青素調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子共聚一簇，推測(cè)FtMYC可能具有類似的調(diào)控功能。在UV-B和4℃冷脅迫處理?xiàng)l件下，F(xiàn)tMYC在苦蕎二葉期胚軸和子葉中的表達(dá)量均表現(xiàn)出一定程度上調(diào)趨勢(shì)，相比之下在子葉中變化趨勢(shì)更為顯著，這種結(jié)果表明FtMYC在苦蕎二葉期更傾向于在子葉中發(fā)揮調(diào)控作用。與此同時(shí)，當(dāng)FtMYC在兩個(gè)組織中的表達(dá)量達(dá)到最大值后在都出現(xiàn)了不同程度下降的趨勢(shì)，可能是因?yàn)橹参锉旧泶嬖谧晕倚迯?fù)機(jī)制，在遭到外界脅迫一定時(shí)間后通過該機(jī)制來維持機(jī)體的代謝平衡[11]。眾所周知，花青素對(duì)UV-B波段存在特定吸收波長(zhǎng)，能有效降低UV-B輻射在表皮層的透過率，從而減輕UV-B對(duì)植物器官與組織的傷害[12]。而當(dāng)植物處于極端溫度逆境下，主要通過影響細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)從而產(chǎn)生氧化脅迫[13]，由于花青素本身具有較強(qiáng)的抗氧化作用，因此花青素在植物組織中的積累可以增強(qiáng)其對(duì)于極端環(huán)境的耐受性[14]。例如，蘋果MdbHLH3轉(zhuǎn)錄因子能在低溫條件下會(huì)特異性結(jié)合MdDFR和MdUFGT基因啟動(dòng)子序列，通過上調(diào)花青素支路的關(guān)鍵基因的表達(dá)促進(jìn)蘋果中花青素的積累[15]。本研究中除了4℃冷處理下FtMYC表達(dá)量與苦蕎胚軸中花青素含量變化沒有明顯的相關(guān)性（r=0.744）外，其他條件下均顯著性相關(guān)。由此可知，F(xiàn)tMYC也可能通過類似的調(diào)控機(jī)制實(shí)現(xiàn)了苦蕎體內(nèi)花青素的積累，以此來應(yīng)對(duì)外界的非生物逆境脅迫。

表2 pFtMYC所含主要元件分析Table 2 Component analysis of pFtMYC

轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是植物基因表達(dá)調(diào)控的一種重要方式，而啟動(dòng)子作為執(zhí)行轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的主要順式作用元件，能應(yīng)答多種環(huán)境的變化[16]。轉(zhuǎn)錄因子對(duì)環(huán)境刺激的響應(yīng)主要是通過其啟動(dòng)子上各類響應(yīng)元件實(shí)現(xiàn)的[17]，Yao P.F.等[18]對(duì)pFtbHLH3研究結(jié)果顯示，干旱脅迫處理會(huì)提高pFtbHLH3下游報(bào)告基因的表達(dá)量。本研究在對(duì)FtMYC啟動(dòng)子的分析中發(fā)現(xiàn)，pFtMYC中除了含有基本的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄元件外，還包含有多個(gè)與光、低溫脅迫應(yīng)答相關(guān)的元件，我們推測(cè)FtMYC的表達(dá)可能通過這些元件響應(yīng)外界環(huán)境的刺激。本課題組后續(xù)也將對(duì)FtMYC的功能展開進(jìn)一步研究，以期明晰FtMYC轉(zhuǎn)錄因子在苦蕎花青素合成的調(diào)控機(jī)制，為提高苦蕎黃酮含量的研究奠定一定的理論基礎(chǔ)。