周永福，陳鴻平，陳 林，劉友平 ，李 應(yīng)

1成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,成都 611137；2重慶工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院,重慶 401120

九里香屬植物具有行氣止痛、活血化瘀之功效[1]；民族民間用于胃痛、風(fēng)濕痹痛、外治牙痛、跌撲腫痛、蟲蛇咬傷[2]；主要含有咔巴唑生物堿、黃酮類、香豆素類等[3]。四數(shù)九里香(MurrayatetrameraHuang)主要分布于海南南部、廣西、云南南部一帶。在當(dāng)?shù)厣贁?shù)民族地區(qū)(彝族、壯族、苗族、傣族)以其干燥葉入藥。臨床上用于局部麻醉、降血糖[3]等。為了闡明其藥效與化學(xué)成分的相關(guān)性，我們對該植物藥做了系統(tǒng)研究。

我們采用冷浸漬法對采自于云南華寧的四數(shù)九里香進行冷浸、過濾、減壓蒸餾、得浸膏；使用硅膠層析柱、凝膠柱色譜、重結(jié)晶等方法對浸膏的乙酸乙酯萃取部分進行分離純化，運用1H NMR、13C NMR、HSQC、HMBC和ESI-MS等波譜方法和文獻數(shù)據(jù)對比，鑒定化合物結(jié)構(gòu)。結(jié)果：從四數(shù)九里香的葉子中鑒定得到7個咔唑類生物堿、1個甾體類化合物：分別為β-谷甾醇(1)、1-甲基-3-丙?；沁?2)、1-甲氧基-3-乙基咔唑(3)、1-甲氧基-3-甲?；沁?4)、1-甲氧基-3-甲基咔唑(5)、1-羧基甲酯-3-甲基咔唑(6)、1-羧基甲酯-3-乙基咔唑(7)、mananimbine(8)。除了化合物1、其他化合物為首次從該植物中分離得到，化合物2、3、4、5、7對SMMC-7721顯現(xiàn)良好的細胞毒活性。

1 儀器及材料

核磁共振儀(TMS為內(nèi)標(biāo)、瑞士bruker公司、400 MHz型)；柱色譜用硅膠GF254(200～300目、青島海洋化工公司)；Sephadex LH-20,ODS2A(50 μm,日本 日本YMC/維美希公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(河南省鞏義市予華儀器有限公司)；循環(huán)水式真空泵：SHZ-D(III)(河南省鞏義市予華儀器有限公司)；低溫冷卻循環(huán)泵(DLSB-5L/25、河南省鞏義市予華儀器有限公司)UtraScan ESI-MS(瑞士bruker公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(濟南鑫貝西生物技術(shù)有限公司)、多功能酶標(biāo)分析儀(MULTISKAN FC)；乙醇、乙酸乙酯、石油醚、甲醇均為工業(yè)純，減壓蒸餾使用。

藥材于2016年2月采自云南省華寧縣,經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)陳新博士鑒定為蕓香科九里香屬四數(shù)九里香MurrayatetrameraHuang的枝葉。植物標(biāo)本(標(biāo)本編號：20160122001)保存于重慶工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院中醫(yī)藥物研究所；SMMC-7721細胞株購自于中國科學(xué)院昆明細胞庫。

2 提取與分離

四數(shù)九里香葉35 kg，晾干、粉碎、60%的乙醇溶液浸提(5×10.0 L×3)、濃縮、合并，得浸膏2.8 kg，溫水溶解、分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取、濃縮得石油醚萃取部分200 g；乙酸乙酯萃取部分680 g；正丁醇萃取部分460 g。

用硅膠色譜柱(200～300目、10 cm×150 cm)對乙酸乙酯萃取部分進行分離、分別用石油醚;乙酸乙酯(20∶1→18∶3→16∶5→14∶7→12∶9→10∶11→8∶13→6∶15→0∶21)為流動相進行洗脫，經(jīng)TLC檢測后合并得39個組分：A1→A39。A1(80 g)經(jīng)過混合溶劑(乙酸乙酯和丙酮)溶解、自然放置得針狀結(jié)晶、重結(jié)晶，得化合物1(45 g，展開劑為：石油醚：乙酸乙酯=20∶1，Rf=0.67)；A1余下部分經(jīng)過硅膠柱色譜、使用環(huán)己烷：乙酸乙酯(30∶1→25∶6→20∶11→15∶16→10∶21)和乙酸乙酯為混合溶劑進行淋洗，得5個餾分：A1-1、A1-2、A1-3、A1-4、A1-5；A1-1(2.0 g)上凝膠色譜柱(2 cm×150 cm)，純化得化合物2(30.8 mg，環(huán)己烷：乙酸乙酯=10∶1，Rf=0.62)；A1-2(4.5 g)上正相硅膠柱子(2 cm×50 cm)，用環(huán)己烷：乙酸乙酯為15∶1淋洗、合并相同部位，自然放置，得晶體，為化合物3(53.65 mg、環(huán)己烷：乙酸乙酯=6∶1，Rf=0.72)；A1-3(5.0 g)上凝膠柱子(3 cm×120 cm)，分成三段：F1-3；F1進行薄層層析刮板，制得化合物4(6.8 mg，石油醚：乙酸乙酯=5∶1，Rf=0.78)、F2進行薄層層析刮板，得化合物5(13.4 mg，石油醚：乙酸乙酯=5∶1，Rf=0.51)、F3進行薄層層析刮板，得化合物6(21.1 mg，石油醚：乙酸乙酯=2∶1，Rf=0.76)；A1-4(7.0 g)，重復(fù)上正相，分為4餾分，各餾分上凝膠、合并相同部分，重結(jié)晶得化合物7、8。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1無色針晶(CHCl3)；1H NMR(400 MHz，CDCl3) δ:7.26(1H,s,-OH),5.35(3H,d,H-6),3.52(1H,dd,H-3),2.17(7H,s,H-8),1.84(7H,m,H-9),1.00(3H,s,H-19),0.92(3H,d,J=6.5 Hz,H-21),0.85(3H,d,J=7.0 Hz),0.83(3H,d,J=6.9 Hz),0.81(3H,d,J=6.8 Hz),0.68(3H,s,H-18);13C NMR(CDCl3,100 MHz) δ:12.01(C-18),12.11(C-26),18.90(C-19),19.04(C-29),19.41(C-21),19.83(C-28),21.09(C-25),23.07(C-15),24.31(C-22),26.07(C-12),27.23(C-27),28.26(C-8),29.16(C-7),31.67(C-2),31.92(C-1),33.95(C-23),36.16(C-20),36.51(C-10),37.26(C-16),39.78(C-4),42.32(C-24),45.84(C-13),50.14(C-9),56.06(C-17),56.78(C-14),71.79(C-3),121.72(C-6),140.77(C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻[4]報道一致，確定化合物為β-谷甾醇。

化合物2油狀(CHCl3)；1H NMR( 400 MHz,CDCl3) δ:8.03(1H,d,J=7.6 Hz,H-5),7.48(1H,d,J=7.6 Hz,H-8),7.36(1H,m,J=7.6 Hz,H-7),7.20(1H,dd,J=7.6 Hz,H-6),6.73(1H,s,H-2),2.15(3H,s,-CH3),1.25(2H,dd,-CH2-);13C NMR(CDCl3,100 MHz) δ:15.46(-CH3),27.06(-CH2-),29.72(-CH3),103.74(C-2),110.74(C-4),111.38(C-1),114.29(C-4a),116.68(C-8),117.85(C-4b),119.60(C-6),124.01(C-3),124.29(C-7),131.01(C-8b),138.87(C-8a),143.77(C-5),154.05(-C=O)。以上數(shù)據(jù)與文獻[5]一致，鑒定化合物為1-甲基-3-丙?；沁颉?/p>

化合物3油狀(CHCl3)；1H NMR( 400 MHz,CDCl3) δ:8.00(1H,d,J=8.00 Hz,H-5),7.44(1H,d,J=8.05 Hz,H-8),7.21(t,J=8.00 Hz,J=8.00 Hz,H-7),7.195(t,J=8.00 Hz,J=8.00 Hz,H-6),3.995(3H,s,-OCH3),1.529(3H,s,-CH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz) δ:21.95(-CH3),29.72(-CH2-),55.48(-OCH3),107.65(C-7),110.90(C-8),112.50(C-4),119.14(C-6),120.46(C-5),123.51(C-3),124.29(C-4a),125.49(C-2),127.96(C-8a),129.45(C-4b),139.44(C-8b),145.32(C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻[6]一致，鑒定化合物為1-甲氧基-3-乙基咔唑。

化合物4油狀(CHCl3)；1H NMR( 400 MHz,CDCl3) δ：10.01(1H,s,-CHO),8.71(1H,s,H-N),8.17(1H,s,H-4),8.10(1H,d,J=8.0 Hz,H-5),7.51(1H,d,J=6.8 Hz,.H-8),7.477(1H,t,J=6.9 Hz,H-7),7.451(1H,s,H-2),7.33(1H,t,J=6.9 Hz,H-6),4.041(3H,s,H-OCH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz) δ:146.26(C-1),139.61(C-8b),130.13(C-3),123.83(C-4a),123.78(C-4b),139.64(C-8a),103.67(C-2),111.71(C-8),120.62(C-4),120.68(C-5),120.86(C-6),126.79(C-7),192.15(1-CHO),55.942(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[7]報道一致，故鑒定化合物為1-甲氧基-3-甲?；沁?。

化合物5油狀(CHCl3)；1H NMR(400 MHz,CDCl3) δ:8.00(1H,d,J=8.00 Hz,H-5),7.44(1H,d,J=8.05 Hz,H-8),7.21(t,J=8.05 Hz,H-7),7.19(t,J=8.00 Hz,H-6),3.99(3H,s,-OCH3),1.53(3H,s,-CH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz) δ:22.17(-CH3),55.57(-OCH3),107.92(C-7),111.20(C-8),112.86(C-4),119.66(C-6),120.65(C-5),123.59(C-3),124.57(C-4a),125.76(C-2),128.30(C-8a),129.68(C-4b),139.73(C-8b),145.54(C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻[8]一致，鑒定化合物為1-甲氧基-3-甲基咔唑。

化合物6油狀(CHCl3)；1H NMR(400 MHz,CDCl3) δ:8.06(1H,d,J=7.6 Hz,H-5),7.58(1H,d,J=8.0 Hz,H-8),7.52(1H,s,H-2),7.38(1H,t,J=7.6 Hz,J=7.2 Hz,H-6),7.17(1H,t,J=8.0 Hz,J=7.2 Hz,H-7),6.85(1H,s,H-4),4.01(3H,s,-OCH3),2.52(3H,s,-CH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz) δ:22.68(-CH3),56.53(-OCH3),109.21(C-7),112.83(d,C-8),113.85(m,C-4),120.17(m,C-6),121.65(m,C-5),124.82(d,C-3),125.75(C-4a),126.78(C-2),129.90(C-8a),130.31(C-4b),141.72(C-8b),147.32(C-1),178.98(C-1-C=O)。以上數(shù)據(jù)與文獻[9]一致，鑒定化合物為1-甲酸甲酯-3甲基咔唑。

化合物7油狀(CHCl3)；1H NMR(400 MHz,CDCl3) δ:8.17(1H,d,J=7.6 Hz,H-5),8.13(1H,s,H-8),7.59(2H,m,J=8.0 Hz,J=8.4 Hz,H-2),7.35(2H,m,J=7.6 Hz,J=8.0 Hz,H-6,H-7),7.29(1H,d,J=7.6 Hz,J=8.0 Hz,H-3),4.62(2H,s,-OCH2-),4.21(3H,s,-OCH3),3.39(3H,s,-OCH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz) δ:58.75(-OCH3),65.18(N-OCH3),76.36(-O-CH2-),109.99(C-7),110.27(C-8),121.63(C-4),121.68(C-6),121.87(C-5),122.04(C-3),122.31(C-4a),128.11(C-2),128.36(C-8a),132.60(C-4b),139.23(C-8b),140.01(C-1).低分辨質(zhì)譜顯示分子離子峰為m/z：241.012;分子式為：C15H15NO2,以上數(shù)據(jù)與文獻[10]一致，鑒定化合物為1-甲醚-9-甲氧基咔唑。

化合物8油狀(CHCl3)；1H NMR(400 MHz,CDCl3) δ:7.94(1H,d,J=7.50 Hz),7.68(1H,s,H-4),7.41(3H,d,J=8.00 Hz,H-5),7.32(t,J=8.10 Hz),6.67(d,J=8.00 Hz,H-8),5.68(1H,d,J=9.8 Hz),4.02(2H,s,H-13),3.52(2H,s),2.55(1H,s),2.36(3H,s),2.20(3H,t),1.48(3H,s)；13C NMR(CDCl3,100MHz) δ:14.15(3-CH3),16.10(10-CH3),22.76(C-13),40.78(C-12),55.48(C-11),104.20(C-1),110.37(C-8),112.50(C-4a),116.61(C-9),117.54(C-3),118.43(C-5),119.20(C-6),121.25(C-4),123.93(C-5a),124.19(C-7),124.19(C-14),125.64(C-15),128.54(C-10),131.70(C-1a),139.45(C-8a),149.91(C-2)。低分辨質(zhì)譜顯示m/z=307.26,[M+H]+,提示化合物分子式為：C21H25NO。以上數(shù)據(jù)與文獻[11]報道的數(shù)據(jù)基本一致，鑒定化合物為mananimbine。

4 細胞毒活性研究

用含10%胎牛血清的RMPI1640培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔5 000 個細胞接種到96孔板，每孔體積100 μL，細胞提前12～24 h接種培養(yǎng)；化合物用DMSO溶解，以100、20、4、0.8、0.16 μg/mL濃度篩選肝癌細胞株SMMC-7721，每孔終體積200 μL，每種處理均設(shè)3個復(fù)孔。37 ℃條件下培養(yǎng)48 h后，棄孔內(nèi)培養(yǎng)液；每孔加MTS溶液20 μL和培養(yǎng)液100 μL；設(shè)3個空白復(fù)孔(MTS溶液20 μL和培養(yǎng)液100 μL的混合液)，繼續(xù)孵育3 h，使反應(yīng)充分進行；選擇492 nm波長，采用多功能酶標(biāo)儀(MULTISKAN FC)讀取各孔光吸收值(A)，應(yīng)用兩點法(Reed and Muench法)計算各化合物的IC50值[12]。

細胞抑制率=(A對照-A樣品)/(A對照-A空白)

每次實驗均設(shè)順鉑(DDP)和紫杉醇(Taxol)兩個陽性對照化合物，以濃度為橫坐標(biāo)，細胞存活率為縱坐標(biāo)繪制細胞生長曲線，應(yīng)用兩點法(Reed and Muench法)計算化合物的IC50值。初步篩查結(jié)果見表1；結(jié)合初步篩查結(jié)果，以化合物編號為橫坐標(biāo)，細胞抑制率為縱坐標(biāo)，制得圖1?；衔锏腎C50值見表2。

表1化合物1～8的肝癌細胞株(SMMC-7721)毒活性初步測試結(jié)果

Table 1 The cytotoxic activity of compound1-8(Preliminary test result)

化合物CompoundSMMC-7721細胞毒活性SMMC-7721 cell inhibition(%)AverageSD順鉑DDP65.72 10.00 紫杉醇Taxol13.17 1.25 12.40 3.32 297.86 0.72 399.04 0.53 499.43 0.31 599.70 0.21 641.62 2.14 795.83 2.02 84.22 1.34

注：與順鉑(DDP)和紫杉醇(Taxol)兩個陽性化合物比較。

Note:Compare with DDP and Taxol.

在100 μg/mL濃度下，單體化合物對肝癌細胞株毒活性初步測試結(jié)果見表1；從表1中明顯看到：與陽性化合物對比，化合物2～5、7對肝癌SMMC-7721的體外腫瘤生長有半數(shù)抑制活性。

以化合物對SMMC-7721細胞的體外腫瘤生長有半數(shù)抑制活性為篩選基礎(chǔ)，進一步分析測試化合物2～5、7的細胞毒活性IC50值。測試結(jié)果見表2。

化合物2～5、7的IC50值表明：與陽性對照物比較，化合物2～5、7對肝癌細胞株SMMC-7721顯現(xiàn)了很好的細胞毒活性。

5 結(jié)論

九里香屬植物四數(shù)九里香MurrayatetrameraHuang具有抗炎癥，抗生育、抗甲狀腺等作用。本實驗通過色譜技術(shù)從中分離制得8個單體化合物，采用現(xiàn)代波譜分析方法鑒定了它們的結(jié)構(gòu)，分別為7個咔唑類生物堿和1個甾體化合物；并以肝癌細胞株(SMMC-7721)為細胞模型，分別對這8個化合物做了細胞毒實驗初步篩選和復(fù)選，研究表明：化合物2～5、7對肝癌細胞株SMMC-7721顯現(xiàn)了很好的細胞毒活性。該研究結(jié)果為四數(shù)九里香抗肝癌活性提供了數(shù)據(jù)和理論支持，為進一步研究開發(fā)民族民間藥物四數(shù)九里香和相關(guān)的抗肝癌新藥提供了堅實的基礎(chǔ)。

表2化合物2～5、7的肝癌細胞株毒活性測試結(jié)果(IC50)

Table 2 The SMMC-7721 cytotoxic activity of compound2-5,7(IC50)

化合物CompoundSMMC-7721IC50±SD(μM)順鉑DDP21.13±1.22紫杉醇Taxol<0.008240.93±0.66346.03±2.054114.21±5.67515.79±0.997185.1±0.44