董超，黃遠(yuǎn)麗，徐正豐

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬荊州醫(yī)院，湖北荊州 434020)

乳腺癌是世界范圍內(nèi)女性最常見的惡性腫瘤之一，我國是乳腺癌的高發(fā)區(qū)，每年新發(fā)病例數(shù)占全球新發(fā)病例的12.2%，死亡病例占全球乳腺癌死亡病例的9.6%，并且呈年輕化趨勢(shì)[1]。腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移是患者致死的最重要原因之一，乳腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移是一個(gè)多基因參與，通過多步驟完成的復(fù)雜的過程，但其具體機(jī)制目前尚不清楚。微小RNA-138(miRNA-138)是家族重要成員之一，其在多種惡性腫瘤中呈低表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中起重要的調(diào)控作用[2]。但至今，有關(guān)miRNA-138在乳腺癌中的研究甚少，并且miRNA-138對(duì)乳腺癌侵襲及遷移的作用及其機(jī)制尚不明確。本研究觀察了miRNA-138模擬物(miRNA-138 mimics)對(duì)人乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、miRNA-138模擬物及主要試劑 人高侵襲性乳腺細(xì)胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468及人低侵襲性乳腺癌細(xì)胞系MCF-7[3]和人正常乳腺上皮細(xì)胞系HBL-100均購自美國ATCC細(xì)胞庫。miRNA-138模擬物(miRNA-138 mimics)及miR陰性對(duì)照模擬物(miR-NC)均購自上海吉瑪制藥技術(shù)公司。RPMI1640培養(yǎng)基、Transwell小室購自購自美國Corning公司，TRIzol試劑購自北京達(dá)科為生物公司，miRNA-138、U6引物購自廣州銳博生物公司，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒均購自美國Bio-Rad公司，Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司，基質(zhì)膠購自美國BD公司，一抗SOX4、E-cadherin、Fibronectin、Vimentin和GAPDH均購自美國CST公司，二抗購自美國Santa Cruz公司。

1.2 MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7、HBL-100中miRNA-138檢測(cè) 將MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7、HBL-100培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1460培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)鑒定總RNA符合實(shí)驗(yàn)要求，取100 ng總RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。取cDNA和引物，配置PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù)，反應(yīng)條件：94 ℃、2 min，94 ℃、20 s，60 ℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)。miRNA-138引物序列：5′-AGCTGGTGTTGTGAATC-3′，5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。以U6作為內(nèi)參基因，以2-ΔΔCt代表miRNA-138相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 miRNA-138模擬物轉(zhuǎn)染及細(xì)胞分組 MDA-MB-231置入含10%胎牛血清的RPMI1460培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24 h，取生長(zhǎng)情況良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞系接種于6孔細(xì)胞板，細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時(shí)采用Lipofectamine2000進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，按照按試劑說明書，分別將miRNA-138 mimics(miRNA-138 mimics組)和miR-NC(miR-NC組)轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231細(xì)胞miRNA-138檢測(cè)方法 采用qRT-PCR法。使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)鑒定總RNA符合實(shí)驗(yàn)要求，取100 ng總RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。取cDNA和引物，配置PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù)，反應(yīng)條件：94 ℃、2 min，94 ℃、20 s，60 ℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)。miRNA-138 引物序列：5′-AGCTGGTGTTGTGAATC-3′,5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。以U6作為內(nèi)參基因，miRNA-138相對(duì)表達(dá)水平應(yīng)用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.5 轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231細(xì)胞侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)測(cè)算 采用Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)。收集轉(zhuǎn)染24 h后的兩組MDA-MB-231細(xì)胞，用無血清DMEM培養(yǎng)基將兩組細(xì)胞重懸成為1×105個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液，對(duì)細(xì)胞預(yù)先饑餓處理24 h。Transwell小室置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，小室底膜上室面均勻基質(zhì)膠包被，Transwell小室上室加入200 μL兩組細(xì)胞懸液，下室加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,常規(guī)培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，棉簽輕柔拭去上室面殘留細(xì)胞，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，染色。倒置顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)不重復(fù)的視野拍照并計(jì)數(shù)穿膜到下室面的細(xì)胞數(shù)目。進(jìn)行Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)時(shí)，小室底膜的上室面不包被基質(zhì)膠，其他操作與Transwell遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.6 轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231細(xì)胞SOX4、E-cadherin、Fibronectin、Vimentin蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。取轉(zhuǎn)染后24 h的兩組細(xì)胞，抽取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。每孔取30 μg總蛋白上樣，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以5%脫脂奶粉封閉液搖床封閉1 h后，加入一抗SOX4、E-cadherin、Fibronectin、Vimentin 和GAPDH，次日洗膜后加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，ECL顯影液顯影，以GAPDH作為對(duì)照，條帶灰度值采用Quality One分析。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌細(xì)胞系及正常乳腺上皮細(xì)胞系中miRNA-138相對(duì)表達(dá)量比較 MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7、HBL-100中miRNA-138相對(duì)表達(dá)量分別為0.23±0.08、0.42±0.05、0.56±0.11、1.03±0.04，MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7與HBL-100比較，MDA-MB-231、MDA-MB-468與MCF-7比較，P均<0.05。

2.2 兩組細(xì)胞系miRNA-138表達(dá)比較 miRNA-138 mimics組和miR-NC組miRNA-138相對(duì)表達(dá)量分別為13.35±0.35、0.98±0.05，兩組比較，P<0.05。

2.3 兩組細(xì)胞系遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)比較 結(jié)果見表1。

表1 兩組細(xì)胞系遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)比較(個(gè)，

注：與miR-NC組比較，*P<0.05。

2.4 兩組細(xì)胞系SOX4、E-cadherin、Fibronectin、Vimentin蛋白灰度值比較 結(jié)果見表2。

表2 兩組細(xì)胞系SOX4、E-cadherin、Fibronectin、Vimentin蛋白灰度值比較

注：與miR-NC組比較，*P<0.05。

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重危害人民健康和生命。目前，臨床上主要采用手術(shù)、化療、放療及內(nèi)分泌治療等綜合手段治療乳腺癌，雖然隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，乳腺癌的診療技術(shù)得到不斷發(fā)展，但過去5年里乳腺癌的總生存率并沒有得到實(shí)質(zhì)性提高[4]。乳腺癌的發(fā)生進(jìn)展機(jī)制涉及多種信號(hào)通路異常和基因突變，目前尚未完全清楚。乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231是從一名51歲的白人女性乳腺癌患者的胸水中分離建立的，該細(xì)胞表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子EGF受體、TGF-α受體和WNT7B癌基因，是被研究者廣泛應(yīng)用的一種高侵襲性乳腺癌細(xì)胞模型[3]。

miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一類約22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的非編碼小分子單鏈RNA，通過降解靶基因mRNA或者抑制其翻譯，調(diào)控著人體約1/3基因的表達(dá)，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程，尤其在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲遷移等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的作用[5]。miRNA-138是近年來發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)的miRNA分子成員之一。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-138在前列腺癌[6]、非小細(xì)胞肺癌[7]、食管鱗狀細(xì)胞癌[8]、宮頸癌[9]等多種惡性腫瘤中表達(dá)降低，作為抑癌基因抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲與遷移。至今有關(guān)miRNA-138在乳腺癌中研究甚少。本研究顯示，miRNA-138在人乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平較人乳腺上皮細(xì)胞明顯降低，這說明miRNA-138在乳腺癌中也起著抑癌基因的作用，與miRNA-138在其他惡性腫瘤中的研究結(jié)果一致。進(jìn)一步我們發(fā)現(xiàn)，miRNA-138在高侵襲性乳腺細(xì)胞中的表達(dá)較低侵襲性乳腺癌細(xì)胞明顯減低，提示miRNA-138可能與乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。

侵襲、轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要的生物學(xué)特征，為了探討miRNA-138對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移能力的影響，我們應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法成功將miRNA-138模擬物轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞中，成功建立過表達(dá)miRNA-138的乳腺癌細(xì)胞模型，Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)miRNA-138的乳腺癌細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)明顯較對(duì)照組減少，提示過表達(dá)miRNA-138能夠明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力。惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制非常復(fù)雜，涉及血管形成、細(xì)胞黏附能力變化、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)等多種因素，其中EMT是影響惡性腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵啟動(dòng)步驟[10,11]。

EMT是指在內(nèi)外部因素的影響下，上皮細(xì)胞失去極性，細(xì)胞間緊密連接消失，獲得侵襲和遷移能力，轉(zhuǎn)化成為具有間質(zhì)細(xì)胞特性細(xì)胞的過程[12]。研究[13,14]發(fā)現(xiàn)，EMT是惡性腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的重要步驟。細(xì)胞發(fā)生EMT的過程中，E-cadherin、α-catenin等上皮細(xì)胞源性標(biāo)志物表達(dá)明顯缺失或降低，而Fibronectin、Vimentin、N-cadherin等間質(zhì)細(xì)胞源性標(biāo)志物表達(dá)明增加[15]。腫瘤細(xì)胞在發(fā)生EMT的過程中，E-cadherin 等細(xì)胞間隙黏連蛋白減少，腫瘤細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，與此同時(shí)細(xì)胞侵襲及遷移能力也明顯增加[16]。既往研究表明，miRNA-138在腎透明細(xì)胞癌[17]和膽囊癌[18]能通過調(diào)控EMT抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲與遷移，但miRNA-138對(duì)乳腺癌EMT的影響尚未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miRNA-138的乳腺癌細(xì)胞中上皮細(xì)胞源性標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯升高，而間質(zhì)細(xì)胞源性標(biāo)志物Fibronectin、Vimentin蛋白表達(dá)的表達(dá)較對(duì)照組明顯降低，證實(shí)miRNA-138能夠通過抑制乳腺癌細(xì)胞EMT抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力。

SOX4屬于SOX家族的重要成員，其定位于人染色體6p22.3 上，在細(xì)胞分化的調(diào)控、胚胎發(fā)育及干細(xì)胞維持方面發(fā)揮著重要作用[19]。近年研究發(fā)現(xiàn)，SOX4在包括乳腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中表達(dá)升高，作為原癌基因發(fā)揮作用。并且研究發(fā)現(xiàn)，SOX4與腫瘤細(xì)胞的EMT密切相關(guān)，是調(diào)控腫瘤細(xì)胞EMT的重要基因。在乳腺癌中也證實(shí)SOX4可以通過調(diào)控EMT促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。近期Liu等[17]證實(shí)，miRNA-138能夠靶向調(diào)控SOX4基因的表達(dá)調(diào)控腎透明細(xì)胞癌EMT，從而影響腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。為了觀察在乳腺癌中miRNA-138是否也能夠調(diào)控SOX4基因表達(dá)影響腫瘤細(xì)胞的EMT，我們通過Western blotting檢測(cè),發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miRNA-138的乳腺癌細(xì)胞中SOX4蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組降低，證實(shí)miRNA-138可能通過調(diào)控SOX4基因調(diào)控乳腺癌細(xì)胞EMT過程，從而影響癌細(xì)胞的侵襲與遷移能力。

總之，miRNA-138 mimics能夠抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移，其機(jī)制可能與調(diào)控SOX4基因抑制乳腺癌細(xì)胞EMT有關(guān)。miRNA-138有可能成為干預(yù)乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移能力的新的治療靶點(diǎn)，為乳腺癌的基因靶向治療提供新的方向。