高 闖,張目涵,王斌斌,杜曉博,王丹丹,楊貝貝,耿 麗,王許平,馮百歲
(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科暨炎癥性腸病中心,吳階平醫(yī)學(xué)基金會炎癥性腸病聯(lián)盟河南省炎癥性腸病中心,鄭州 450014;*通訊作者,E-mail:fbs163@163.com)
炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是一類多種病因引起、異常免疫反應(yīng)介導(dǎo)的腸道慢性復(fù)發(fā)性炎癥,包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)和克羅恩病(crohn’s disease,CD)。腸道黏膜屏障功能受損是炎癥性腸病的重要發(fā)病機制,當(dāng)腸道黏膜屏障受損后加重致病菌的感染,通過細(xì)菌氧耗增加、激活缺氧敏感通路等途徑造成腸道缺氧區(qū)域的形成[1]。金屬硫蛋白(metallothionein,MT)是一類富含半胱氨酸的低分子量蛋白質(zhì),共有四種亞型,分別為MT-1、MT-2、MT-3和MT-4。其中主要亞型為MT-1和MT-2,廣泛分布于多種組織器官中[2]。MT-1/2作為體內(nèi)重要的抗氧化劑,因為它的結(jié)構(gòu)域中含有大量處于還原狀態(tài)的巰基,是其發(fā)揮抗氧化作用的活性中心[3],在腸道炎癥中MT可能通過參與抑制氧化損傷作用來發(fā)揮保護腸道屏障功能的作用。正常條件下核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)的表達(dá)受到抑制,當(dāng)組織發(fā)生缺氧及炎癥條件下可以促進NF-κB的表達(dá)[4]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)在組織中具有高度的氧敏感性,細(xì)胞正常氧濃度下HIF-1α可以發(fā)生降解,缺氧環(huán)境可以增加HIF-1α的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性且處于高表達(dá)狀態(tài)[5]。本文通過檢測MT、NF-κB及HIF-1α的表達(dá)水平及其相關(guān)性來探究它們在炎癥性腸病中的作用,從而為炎癥性腸病的治療提供新思路。
收集2017-06~2018-06鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院住院的炎癥性腸病患者結(jié)腸組織活檢石蠟包埋標(biāo)本及血清樣本,其中UC患者30例,年齡18-55歲,平均(35.4±6.6)歲;CD患者30例,年齡20-60歲,平均(38.2±7.8)歲。所有患者均符合2018年中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會炎癥性腸病學(xué)組制定的UC及CD診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。另外選取的30例結(jié)腸組織對照組均為結(jié)直腸癌患者外科手術(shù)切除距癌組織5 cm以上的結(jié)腸組織,年齡25-55歲,平均年齡(40.7±8.5)歲。30例健康志愿者血清標(biāo)本作為對照,年齡23-50歲,平均年齡(31.2±7.4)歲。所有對象受試前均未接受糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑等治療,未合并其他自身免疫性疾病。研究對象均簽署知情同意書。
MT及NF-κB的表達(dá)IBD患者的活檢組織及結(jié)直腸癌患者的癌旁組織進行石蠟包埋切片,組織切片經(jīng)脫蠟、水化、封閉、抗原微波修復(fù)、分別滴加兔抗人多克隆抗體MT(博奧森生物技術(shù)公司)及NF-κB p65(美國Affinity公司)(稀釋濃度分別是1 ∶400及1 ∶100)、滴加生物素標(biāo)記的二抗、過氧化物酶復(fù)合物、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、各步驟之間用PBS沖洗3次,每次5 min,依次脫水、透明、封片。以PBS代替一抗作陰性對照,以已知陽性切片作陽性對照。均嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟進行操作。免疫組織化學(xué)染色在光鏡(400倍)下選取5個不重復(fù)視野觀察,胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒的細(xì)胞為陽性細(xì)胞,取每個視野下平均陽性細(xì)胞作為計數(shù)標(biāo)準(zhǔn),陽性細(xì)胞所占百分比:0-25%為0分,26%-50%為1分,51%-75%為2分,≥75%為3分;染色強度:無色或黃色為1分,棕色為2分,褐色為3分,以上兩項得分之和≥3分為陽性,<3分為陰性。
所有研究對象均在清晨空腹抽取3 ml靜脈血,離心后取血清凍存,應(yīng)用ELISA試劑盒檢測UC組、CD組及健康對照組血清中HIF-1α的質(zhì)量濃度,試劑購買自美國R&D公司,實驗嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。
正常對照組、UC組、CD組結(jié)腸黏膜組織中MT表達(dá)陽性率分別為80%(24/30),20%(6/30)和24%(7/30);NF-κB的表達(dá)陽性率分別為17%(5/30),90%(27/30)和87%(26/30)。各組結(jié)腸組織中MT和NF-κB表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。其中MT的表達(dá)UC組和CD組低于正常對照組,NF-κB的表達(dá)UC組和CD組高于正常對照組。各組結(jié)腸組織中MT的表達(dá)見圖1,NF-κB的表達(dá)見圖2。
CD組和UC組血清中HIF-1α的表達(dá)水平高于正常對照組(均P<0.05,見表1)。
A.正常對照組B.CD組C.UC組圖1 各組結(jié)腸組織中MT的表達(dá)Figure 1 Expression of MT in colon tissue of each group
A.正常對照組B.CD組C.UC組圖2 各組結(jié)腸組織中NF-κB的表達(dá)Figure 2 Expression of NF-κB in colon tissue of each group
表1各組血清中HIF-1α的表達(dá)水平(pg/ml)
Table1ExpressionlevelsofHIF-1αinserumofeachgroup(pg/ml)
組別nHIF-1αFP正常對照組3083.08±21.349.685<0.05CD組30234.72±62.32?UC組30209.56±54.18?
與正常對照組比較,*P<0.05
使用Pearson相關(guān)性分析檢測各組結(jié)腸組織中MT的表達(dá)與結(jié)腸組織中NF-κB的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.792,P<0.01);各組結(jié)腸組織中MT的表達(dá)與血清中HIF-1α的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.746,P<0.01);各組結(jié)腸組織中NF-κB的表達(dá)與血清中HIF-1α的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.814,P<0.01)。
炎癥性腸病是一種病因和發(fā)病機制尚不十分清楚的腸道慢性非特異性炎癥性疾病,其發(fā)病機制十分復(fù)雜,涉及感染、免疫、遺傳、環(huán)境等因素[7]。研究發(fā)現(xiàn)在炎癥條件下造成結(jié)腸黏膜缺氧區(qū)域形成是炎癥性腸病重要的發(fā)病機制之一[8]。結(jié)腸炎癥反應(yīng)可以引起多種活性氧物質(zhì),包括過氧化物、超氧化物、有機氧、單體氧等,這類活性氧主要在內(nèi)源性線粒體氧化呼吸鏈產(chǎn)生,腸道炎癥條件下促進活性氧物質(zhì)大量表達(dá),抑制線粒體氧化反應(yīng),減少ATP的產(chǎn)生,影響結(jié)腸細(xì)胞能量供給,進一步加重炎癥反應(yīng)[9]。
MT是由多種應(yīng)激條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類應(yīng)激反應(yīng)蛋白,它的結(jié)構(gòu)中大量巰基結(jié)構(gòu)可以直接發(fā)揮抗氧化作用,同時研究表明MT可以直接參與氧化呼吸中三羧酸循環(huán)中ATP酶硝基化促進葡萄糖利用及能量供給[10],又可以通過抑制活性氧合成酶減少活性氧的產(chǎn)生來減輕炎癥損傷,所以MT可以通過多種機制發(fā)揮其高效細(xì)胞保護劑的作用[11]。
NF-κB是1986年在B淋巴細(xì)胞的細(xì)胞核提取物中發(fā)現(xiàn)的,正常條件下NF-κB與細(xì)胞內(nèi)源性抑制物IB(inhibitor of NF-κB,IB)結(jié)合呈非活性狀態(tài)[12]。研究證明NF-κB是一種多效的信號轉(zhuǎn)錄因子,受多種因素如趨化因子、氧化應(yīng)激等刺激而激活后可以參與機體多種炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等多種變化過程[13]。本研究結(jié)果顯示不同結(jié)腸黏膜中MT和NF-κB的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),同時MT與NF-κB的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.792,P<0.01),研究發(fā)現(xiàn)MT可以通過抑制IB解離來抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性[14],提示MT可能通過抑制NF-κB的激活在腸道的保護機制中發(fā)揮作用。
HIF-1α是一種隨細(xì)胞氧含量變化而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄激活因子,正常細(xì)胞環(huán)境中HIF-1α處于不穩(wěn)定狀態(tài),容易被氧依賴的泛素蛋白酶體所降解,缺氧環(huán)境中HIF-1α穩(wěn)定性增加并且在多種組織中大量表達(dá)[15]。HIF-1α可以促使多種基因表達(dá)通過增加缺氧組織供氧能力或增強缺氧細(xì)胞的缺氧耐受能力來代償性維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性[16]。研究表明NF-κB信號通路激活可以促進HIF-1α的表達(dá)[17]。本研究結(jié)果顯示UC及CD患者血清中HIF-1α的表達(dá)高于正常對照組(P<0.05)。各組結(jié)腸黏膜中NF-κB的表達(dá)與血清中HIF-1α的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.814,P<0.01)。
綜上所述,MT表達(dá)變化可能影響NF-κB及HIF-1α的表達(dá)參與炎癥性腸病的發(fā)病過程,因此進一步了解MT的作用機制可以提供炎癥性腸病新的治療靶點。