張 蘭,溫路生,林月麗,鄒雙優(yōu),尹 晶,陳 慧*

(1廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院婦產(chǎn)科,漳州 363000;2廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院病理科;*通訊作者,E-mail:chenhui175@163.com)

宮頸癌(cervical cancer,CCa)是女性常見惡性腫瘤之一,病因尚未完全明確,大量的臨床資料顯示早婚、早育、多產(chǎn)及性生活紊亂等的婦女罹患宮頸癌的幾率明顯增高。目前宮頸癌病死率居于婦科惡性腫瘤的第2位,嚴(yán)重影響婦女的心身健康和生活質(zhì)量[1]。因此,如何早期診斷、及時(shí)治療宮頸癌具有重要的臨床意義。近年來研究發(fā)現(xiàn),電壓門控型鉀離子通道的亞型—Eag1通道僅在人腦組織中高表達(dá),但卻異常表達(dá)于如乳腺癌、卵巢癌、胃癌、結(jié)腸癌、軟組織肉瘤等多種惡性腫瘤中并與這些腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān),已成為一個新興的腫瘤分子治療靶點(diǎn)[2-4]。目前關(guān)于Eag1基因與宮頸癌的研究較少,Eag1基因在宮頸癌中的表達(dá)、作用及意義尚不明確。本研究旨在探討Eag1基因在不同宮頸病變組織中的表達(dá)情況,及與宮頸癌患者臨床分期、預(yù)后的關(guān)系,為宮頸癌的靶向治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

隨機(jī)選取(電腦隨機(jī)選取此期間的宮頸癌患者ID號)2013-01～2018-01期間在解放軍第一七五醫(yī)院暨廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院婦產(chǎn)科診治的共105例宮頸病變病例,所有標(biāo)本最終均經(jīng)本院病理科病理診斷證實(shí)。該研究由我院醫(yī)學(xué)倫理研究委員會嚴(yán)格審查,患者被告知使用標(biāo)本并在該研究前簽署知情同意書。選取宮頸上皮內(nèi)瘤變CIN 30例(其中CIN1級、2級、3級各10例),宮頸鱗癌45例(其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期各10例,Ⅳ期15例)。另取因子宮肌瘤等行全子宮切除的瘤旁正常宮頸組織病例30例。將每個樣本平均分為兩份,并在-70 ℃冷凍,一份用RT-PCR檢測,另一份用4%甲醛固定,嵌入石蠟,切片厚度4 μm,最后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

1.2 試劑與方法

Eag1抗體購自美國Thermo Fisher公司,按試劑盒說明書進(jìn)行免疫組化操作。從美國的Santa Cruz公司購買了辣根過氧化物酶偶聯(lián)山羊抗兔血色素抗體;從上海Sangon公司購買了ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒。

1.3 免疫組化檢測Eag1的蛋白表達(dá)

石蠟包埋組織連續(xù)切片(厚度4 μm),脫蠟,水化,PBS沖洗3×5 min后置于10 mmol/L檸檬酸緩沖(pH 6.0)中在高溫和高壓下修復(fù)抗原后。冷卻至室溫,再次用PBS沖洗3次。滴加一抗50 μl(兔抗人Eag1鉀通道抗體,稀釋濃度1 ∶200)在4 ℃下過夜。37 ℃復(fù)溫45 min,PBS沖洗3次。DAB-H2O2孵育5-10 min(在顯微鏡下掌握染色程度),PBS沖洗10 min,蘇木精染色,脫水,透明,封片。陰性對照組用PBS代替原抗體。陽性結(jié)果表明:1號鉀通道蛋白的陽性表達(dá)為透明褐色,背景明顯,位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中。統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[5]的方法,根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)和陽性染色強(qiáng)度,分為0,1,2,3分。0分為少于10%的細(xì)胞染色陽性,1分為大于10%的細(xì)胞呈弱陽性染色,2分為大于10%的細(xì)胞呈中等陽性染色,3分為大于10%的細(xì)胞呈強(qiáng)陽性染色。其中0分為陰性表達(dá),1,2,3分為陽性表達(dá)。1分為弱陽性表達(dá),2和3分為強(qiáng)陽性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行了卡方檢驗(yàn)和Fisher’s精確檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 Eag1在宮頸癌中的表達(dá)升高

30例子宮肌瘤正常宮頸組織中,2例Eag1為陽性表達(dá)(6.7%),其余均為陰性表達(dá)。30例宮頸上皮內(nèi)瘤變標(biāo)本中,3例CIN 3級標(biāo)本中Eag1為陽性表達(dá),3例CIN 2級標(biāo)本中Eag1為陽性,2例CIN 1級標(biāo)本中Eag1為陽性表達(dá),陽性表達(dá)率為26.7%(見圖1)。45例宮頸癌組織標(biāo)本中,38例標(biāo)本中Eag1為陽性表達(dá),陽性表達(dá)率為84.4%(見圖2)。與正常宮頸組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變組織相比,Eag1在宮頸癌組織的表達(dá)明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.030)。

2.2 Eag1在宮頸癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度與臨床分期有關(guān)

10例Ⅰ期的宮頸癌組織中,2例為Eag1陰性表達(dá),4例為Eag1弱陽性表達(dá),4例為Eag1強(qiáng)陽性表達(dá),陽性表達(dá)率為80%,強(qiáng)陽性表達(dá)率為40%。10例Ⅱ期的宮頸癌組織中,1例為Eag1陰性表達(dá),4例為Eag1弱陽性表達(dá),5例為Eag1強(qiáng)陽性表達(dá),陽性表達(dá)率為90%,強(qiáng)陽性表達(dá)率為50%。在10例Ⅲ期的宮頸癌組織中,Eag1的表達(dá)情況與其在Ⅱ期宮頸癌組織一樣。15例Ⅳ期的宮頸癌組織中,Eag1均為陽性表達(dá),其中3例為Eag1弱陽性表達(dá),12例為強(qiáng)陽性表達(dá),因此陽性表達(dá)率為100%,強(qiáng)陽性表達(dá)率為80%。Eag1在不同分期的宮頸癌組織中的陽性表達(dá)率無明顯差異,但表達(dá)強(qiáng)度差異明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.011，見表1)。

圖1 不同分級宮頸上皮內(nèi)瘤變組織Eag1表達(dá) (SP法,×100)Figure 1 Eag1 expression in cervical intraepithelial neoplasia tissues (SP,×100)

圖2 不同分期宮頸鱗癌組織Eag1表達(dá) (SP法,×100)Figure 2 Eag1 expression in cervical carcinoma tissues (SP,×100)

表1不同臨床分期中Eag1的表達(dá)情況

Table1ExpressionofEag1incervicalcarcinomatissues

臨床分期強(qiáng)陽性弱陽性陰性合計(jì)Ⅰ期44210Ⅱ期54110Ⅲ期54110Ⅳ期123015合計(jì)2615445

3 討論

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,尤其在發(fā)展中國家的患病率更高。近年來隨著社會的開放,過早性生活和性生活紊亂等原因,其發(fā)病率呈明顯上升且年輕化趨勢。宮頸癌起病較為隱匿,早期無明顯特異性臨床癥狀,故大多數(shù)患者會缺乏重視,因此在發(fā)現(xiàn)病情時(shí)已是臨床中晚期。因此,我們急需尋找可以早期診斷并提示患者預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志。

在細(xì)胞膜表面的眾多離子通道中,鉀離子通道的分布最廣泛、家族規(guī)模最龐大[3]。細(xì)胞許多重要的生理病理過程,如細(xì)胞膜電位的形成、激素分泌、興奮性、基因表達(dá)、細(xì)胞增殖和凋亡與鉀離子通道密切相關(guān)。最近的研究發(fā)現(xiàn),多種鉀離子通道的亞族除了在細(xì)胞正常的生理活動中發(fā)揮重要作用,也參與了多種腫瘤細(xì)胞的增殖、周期、凋亡和侵襲等過程[4]。其中,Eag1是最受關(guān)注的一種亞族。Eag1最早發(fā)現(xiàn)于果蠅體內(nèi),它是電壓門控型鉀離子通道的成員之一,由EAG(ether à go-go)基因編碼。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),在正常人體組織中,Eag1在腦組織中高度表達(dá),在胎盤中少量表達(dá),并在肌細(xì)胞中短暫表達(dá)。但是Eag1在多種人類腫瘤細(xì)胞和組織中高度表達(dá),且參與了腫瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期等過程[5,6]。之后的研究證實(shí):Eag1可能受miR-296-3p[7]、miR-155[8]、miR-34a[9]等的調(diào)控。此外,它還有助于惡性細(xì)胞的生長和癌前病變的惡性轉(zhuǎn)化[10]。進(jìn)一步的研究表明,Eag1的表達(dá)水平與腫瘤大小、轉(zhuǎn)移、分期、浸潤深度等有關(guān),可提示惡性腫瘤患者的臨床預(yù)后[11]。因此,Eag1已成為一個明確的癌基因,但其在宮頸癌中的作用和可能的機(jī)制尚不明確。

本研究中,Eag1在宮頸癌組織的表達(dá)陽性率明顯高于正常宮頸組織和宮頸上皮內(nèi)瘤變組織,提示Eag1可能與宮頸癌的發(fā)生有一定的關(guān)聯(lián)。而在45例宮頸癌組織標(biāo)本中,Eag1陽性表達(dá)率高于80%,且大部分為強(qiáng)表達(dá)。進(jìn)一步研究表明:臨床分期越高,Eag1的表達(dá)強(qiáng)度越高,提示Eag1與宮頸癌患者的預(yù)后有關(guān)。

綜上所述,在臨床病理分期較高的病例中,Eag1的高陽性表達(dá)率證實(shí)了Eag1可能參與了宮頸癌發(fā)展的過程,而且宮頸癌患者Eag1表達(dá)水平與臨床預(yù)后有顯著相關(guān)性。檢測宮頸病變中的Eag1蛋白可作為判斷患者是否存在潛在的惡性危險(xiǎn)的依據(jù)。但上述研究仍存在不足,在接下來的研究中我們將檢測Eag1在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)和作用并繪制不同病理分期宮頸癌患者的生存曲線以進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)論。