劉 寧,朱 勇,劉昌奎,郭 芳,黃 碩,李 芳

(1西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系口腔頜面外科學(xué)教研室,西安 710021;2軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點實驗室,國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心,陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室,空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院修復(fù)科;*通訊作者,E-mail:ningliu@xiyi.edu.cn)

隨著口腔種植學(xué)的飛速發(fā)展,口腔種植義齒已不再是傳統(tǒng)義齒修復(fù)的補充手段,而成為患者較為理想的義齒修復(fù)方式,被贊譽為人類的第三副牙齒。然而,由于牙齒拔除后牙槽嵴的吸收改建,常導(dǎo)致患者牙槽嵴寬度、高度不足,限制種植體的植入。自體骨移植是骨組織缺損修復(fù)的金標(biāo)準(zhǔn),但由于口腔內(nèi)種植區(qū)可利用的自體骨量有限,異位取骨又伴隨多種并發(fā)癥,因此多種骨替代材料被研制和開發(fā)出來[1]。去蛋白牛骨無機材料(deproteinized bovine bone,DBB)是目前口腔臨床廣泛應(yīng)用的骨替代材料,具有較高的親水性、與人體骨組織相似的晶體結(jié)構(gòu),但其生物相容性一般、缺乏成骨誘導(dǎo)能力、不能促進(jìn)多潛能間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化,限制其成骨效果[2]。淫羊藿苷(icariin,ICA)是一種良好的骨性誘導(dǎo)因子,性質(zhì)穩(wěn)定,能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化[3]。堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)是間充質(zhì)干細(xì)胞早期成骨分化的指標(biāo)。本研究擬運用仿生磷酸鈣涂層技術(shù),將ICA負(fù)載到DBB表面的磷酸鈣(calcium phosphate,CaP)涂層中,檢測脂肪干細(xì)胞(adipose derived mesenchymal stem cells,ASCs)在改性材料上的ALP活性,為改性材料用于臨床骨再生治療提供實驗室依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康雄性C57小鼠,2周齡,4只,向空軍軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心申領(lǐng)。

1.2 主要試劑和儀器

α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS緩沖液(Hyclone,美國),膠原酶Ⅰ型(Sigma,美國),淫羊藿苷(源葉生物,中國),成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒、成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒、茜素紅、油紅O染液(賽業(yè),中國)。超凈工作臺、低溫高速離心機(Thermo,美國),二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(三洋,日本),倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)(Nikon,日本),掃描電鏡(JEOL,日本),酶標(biāo)儀(Tecan,瑞士)。

1.3 脂肪干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察

4只2周齡C57雄鼠過量麻醉處死,無菌條件下,取雙側(cè)腹股溝脂肪組織置于培養(yǎng)皿中,清除外包膜及肉眼可見的小血管,PBS清洗后剪碎成約為1 mm3組織塊,加入0.075%的膠原酶37 ℃振蕩消化60 min。待消化完成后,1 000 r/min離心5 min。棄上清,向離心管內(nèi)加入2 ml含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液,再次1 000 r/min離心5 min。加入5 ml培養(yǎng)液重懸,將懸液接種于25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi),置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d后換液,顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞融合度達(dá)到80%時傳代,將細(xì)胞培養(yǎng)至第3代,進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4 成骨誘導(dǎo)及成脂誘導(dǎo)

成骨誘導(dǎo)實驗取第3代ASCs,消化后以105個/孔的密度接種于包被0.1%明膠的6孔板中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到60%-70%融合度時,向6孔板中加入2 ml脂肪間質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液,每3 d換1次液。培養(yǎng)至21 d,4%多聚甲醛溶液固定30 min,PBS漂洗3遍,茜素紅染液常溫染色15 min,PBS漂洗3遍,將培養(yǎng)板置于顯微鏡下觀察成骨染色效果。

成脂誘導(dǎo)實驗取第3代ASCs,消化后以105個/孔的密度接種于6孔板中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到100%融合時,小心地吸走培養(yǎng)液,向孔板中加入2 ml成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液。成脂誘導(dǎo)18 d,4%多聚甲醛溶液固定30 min,PBS漂洗3遍,油紅O染料工作液染色30 min,PBS漂洗3遍,將培養(yǎng)板置于顯微鏡下觀察成脂染色效果。

1.5 仿生礦化磷酸鈣涂層的制備及掃描電鏡觀察

將0.1 g DBB材料浸泡在10 ml 5倍模擬體液(simulated body flude,SBF)(684 mmol/L NaCl;21 mmol/L NaHCO3;5 mmol/L Na2HPO4·2H2O;7.5 mmol/L MgCl2·2H2O)中24 h,冷凍干燥,則在材料表面形成一層無定型CaP涂層。然后將其浸泡在1 ml飽和SBF(2 mmol/L Na2HPO4·2H2O;40 mmol/L HCl;4 mmol/L CaCl2·2H2O;50 mmol/L TRIS base)中48 h,冷凍干燥,則在無定型CaP涂層表面形成結(jié)晶狀CaP涂層[4]。將材料脫水、干燥、噴金,場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察材料表面形態(tài)。

1.6 細(xì)胞附著的掃描電鏡觀察

取生長狀態(tài)良好的第3代ASCs,0.25%胰蛋白酶消化1 min,1 000 r/min離心5 min,收集細(xì)胞,調(diào)整密度為106個/ml的細(xì)胞懸液。將0.1 ml上述細(xì)胞懸液均勻滴加于板底放有DBB或CaP涂層改性DBB的96孔板中。細(xì)胞接種于支架材料上24 h,吸棄原培養(yǎng)液,PBS小心漂洗3遍,2.5%戊二醛固定12 h。50%，70%，80%，90%，95%的乙醇脫水1次,100%乙醇脫水2次,每次15 min。臨界點干燥,噴金,掃描電鏡觀察細(xì)胞在材料上的附著、伸展情況。

1.7 堿性磷酸酶活性檢測

涂層制備時在飽和SBF溶液中加入5 mg/L的ICA,ICA會隨著結(jié)晶狀CaP涂層的形成沉積到CaP晶體中,從而制備負(fù)載ICA的CaP涂層改性DBB材料。將實驗分為3組:DBB組(未經(jīng)處理的DBB);CaP組(CaP涂層改性的DBB);ICA-CaP組(CaP涂層內(nèi)含有ICA的DBB)。將各組材料置于12孔板中,每孔放入0.2 g材料,用含10% FBS的α-MEM培養(yǎng)液潤濕材料。取生長狀態(tài)良好的第3代ASCs,消化、離心、重懸,血細(xì)胞計數(shù)器計數(shù),將細(xì)胞密度調(diào)整為5×105個/ml的細(xì)胞懸液,12孔板每孔加入1 ml細(xì)胞懸液均勻接種,5% CO2孵育箱內(nèi)孵育,每3-4 d換一次培養(yǎng)液。培養(yǎng)至第7天吸棄培養(yǎng)液,PBS漂洗3遍,每孔加入1 ml 1% Triton X-100,37 ℃孵育1 h,吸出裂解液,離心后取上清。在96孔板中,按照堿性磷酸酶測定試劑盒和BCA蛋白含量檢測試劑盒說明書要求進(jìn)行檢測。根據(jù)公式計算堿性磷酸酶活性:堿性磷酸酶(U/g)=(測定孔吸光度-空白孔吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)孔吸光度-空白孔吸光度)×酚標(biāo)準(zhǔn)品濃度(0.02 mg/ml)÷待測樣品蛋白濃度(g/ml)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,實驗結(jié)果采用one-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計分析,并采用最小顯著差法(least significant difference,LSD)進(jìn)行組間比較,以雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脂肪干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

原代細(xì)胞培養(yǎng)3 d,顯微鏡下ASCs呈簇或散在分布,大部分細(xì)胞呈纖維細(xì)胞樣梭形,突起細(xì)長,部分細(xì)胞呈多邊形(見圖1)。

圖1 顯微鏡下觀察ASCs的細(xì)胞形態(tài) (×100)Figure 1 The morphology of ASCs under a microscope (×100)

2.2 成骨誘導(dǎo)及成脂誘導(dǎo)

ASCs成骨誘導(dǎo)21 d,茜素紅染色,顯微鏡下觀察可見大量散在分布的紅色礦化結(jié)節(jié),外圍呈橘紅色,中心呈紅棕色(見圖2A)。ASCs成脂誘導(dǎo)18 d,油紅O染色,顯微鏡下觀察可見細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)含有大量大小不等的橘紅色圓形脂滴(見圖2B)。

2.3 材料表面形貌及細(xì)胞附著的掃描電鏡觀察

DBB的表面為不平坦的溝壑狀形貌(見圖3A、3B)。CaP涂層改性DBB的表面為相互交錯的網(wǎng)格狀結(jié)晶體(見圖3D、3E)。ASCs接種在支架材料上24 h后的細(xì)胞形態(tài),DBB和CaP涂層表面附著的細(xì)胞均鋪展良好,細(xì)胞形態(tài)完整呈扁平多角形,伸出偽足,但CaP涂層表面附著的細(xì)胞量相對較多,彼此連接呈片狀(見圖3C、3F)。

A.茜素紅染色(×100) B.油紅O染色(×200)圖2 ASCs成骨和成脂誘導(dǎo)染色Figure 2 Staining of ASCs osteogenesis and lipogenic induction

2.4 堿性磷酸酶活性檢測

ASCs在支架材料上培養(yǎng)7 d后的ALP活性結(jié)果(見圖4)。DBB組與CaP組的ALP活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義。ICA-CaP組的ALP活性顯著高于DBB組和CaP組(P<0.05)。

3 討論

DBB是目前口腔臨床骨再生手術(shù)中廣泛應(yīng)用的骨替代材料[5-7]。它是將小牛松質(zhì)骨經(jīng)多次煅燒和化學(xué)處理,徹底去除其中的有機成分,從而保留下來的基本骨小梁結(jié)構(gòu),是一種天然的具有骨引導(dǎo)性能的多孔支架材料。DBB的主要成分是羥基磷灰石,化學(xué)組成及晶體結(jié)構(gòu)與人體松質(zhì)骨接近。其具有較高的親水性,三維立體的多孔結(jié)構(gòu),可引導(dǎo)細(xì)胞向其內(nèi)部生長和營養(yǎng)物質(zhì)的進(jìn)入。然而,DBB自身缺乏成骨誘導(dǎo)性能,不能誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[7]。為了克服這個缺點,本研究擬運用仿生磷酸鈣涂層技術(shù),將ICA負(fù)載到DBB表面,從而提高DBB促進(jìn)骨再生的能力。

A.低倍鏡下DBB表面形貌 (×100); B.高倍鏡下DBB表面形貌 (×5 000); C.ASCs在DBB表面附著24 h后細(xì)胞形態(tài) (×500);D.低倍鏡下CaP涂層表面形貌 (×100);E.高倍鏡下CaP涂層表面形貌 (×5 000);F.ASCs在CaP涂層表面附著24 h后細(xì)胞形態(tài) (×500)圖3 材料表面形貌及細(xì)胞附著的掃描電鏡觀察Figure 3 Observation of surface morphology and cell attachment of scaffolds under scanning electron microscopy

與其他兩組比較,*P<0.05圖4 ASCs在支架材料上培養(yǎng)7 d后的ALP活性Figure 4 The ALP activity of ASCs cultured on the scaffolds for 7 d

ASCs是近年研究發(fā)現(xiàn)的一種新的成體干細(xì)胞,該細(xì)胞取材方便,增殖能力強,具有一定的免疫調(diào)節(jié)能力和多向分化潛能。De Ugarte等[8]的研究顯示,人脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞與骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化能力沒有明顯區(qū)別。近年來,人們逐漸認(rèn)識到ASCs與三維支架材料聯(lián)合應(yīng)用,可方便臨床上ASCs的移植操作,并且可有效促進(jìn)組織再生[9,10]。因此,本研究選擇ASCs作為研究誘導(dǎo)成骨分化的種子細(xì)胞。然而細(xì)胞的原代培養(yǎng)是細(xì)胞學(xué)實驗研究的基礎(chǔ),實驗首先采用膠原酶消化和密度梯度離心法對細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng),鏡下觀察細(xì)胞呈纖維細(xì)胞樣梭形。多向分化潛能是干細(xì)胞的重要生物學(xué)特性之一,成骨和成脂分化是干細(xì)胞的兩個基本分化方向,是目前公認(rèn)的用于鑒定干細(xì)胞分化功能的方法。實驗分別將ASCs進(jìn)行成骨和成脂誘導(dǎo),誘導(dǎo)一段時間后可見細(xì)胞間出現(xiàn)大量的礦化結(jié)節(jié)和脂滴,表明細(xì)胞具備多向分化潛能,為本研究改性材料生物相容性和成骨誘導(dǎo)性能的檢測提供所需要間充質(zhì)干細(xì)胞。

在眾多的涂覆方式中,仿生磷酸鈣涂層技術(shù)是一種簡便、高效的涂覆方法。不同于高溫等離子噴涂,仿生磷酸鈣涂層在生理溫度和pH條件下就會發(fā)生沉積,形成的晶體結(jié)構(gòu)與骨質(zhì)結(jié)構(gòu)類似[11],且隨著CaP涂層晶體的形成,成骨誘導(dǎo)因子通過共沉積會結(jié)合到涂層的網(wǎng)絡(luò)結(jié)晶中并保持活性,從而賦予材料成骨誘導(dǎo)性能[12]。本研究采用仿生磷酸鈣涂層技術(shù)對DBB表面進(jìn)行改性。掃描電鏡實驗結(jié)果表明,CaP涂層成功實現(xiàn)在DBB表面沉積,DBB表面原本是不平坦的溝壑狀形貌,CaP涂層沉積后變成相互交錯的網(wǎng)格狀結(jié)晶體,CaP涂層增大了DBB的孔隙和表面積。ASCs附著實驗的掃描電鏡結(jié)果顯示,CaP涂層表面附著的細(xì)胞數(shù)量相對較多,說明相比未經(jīng)處理的DBB,ASCs在CaP涂層改性的DBB表面更容易附著。

ICA是從淫羊藿中提取的一種黃酮類化合物,是淫羊藿的主要活性成分之一,分子式為C33H40O15,分子量為676.65,價格低廉,性質(zhì)穩(wěn)定,常用于治療骨折及與骨代謝相關(guān)的疾病[13]。目前淫羊藿苷對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨作用研究較多,體外和體內(nèi)實驗證實ICA能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化,是一種良好的骨性誘導(dǎo)因子[14-16]。近年研究表明,淫羊藿苷亦可促進(jìn)脂肪、牙周膜等組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化,但是此類研究相對較少。在ICA作用于ASCs的成骨分化研究上,僅檢索到寧兆榮等[17]通過兔下頜骨缺損再生的體內(nèi)研究,證實ASCs復(fù)合負(fù)載淫羊藿苷的支架材料具有明顯的促進(jìn)骨缺損修復(fù)能力,效果優(yōu)于其他組。ALP是間充質(zhì)干細(xì)胞早期成骨分化的指標(biāo),本研究將ASCs接種在ICA-CaP涂層改性的DBB表面并培養(yǎng)7 d,隨后檢測ALP活性,結(jié)果顯示ICA-CaP組的ALP活性顯著高于其他組(P<0.05),表明ICA可以有效促進(jìn)ASCs的成骨分化,從而證明ICA-CaP涂層改性的DBB具有成骨誘導(dǎo)性能。然而,淫羊藿苷在材料上的最佳負(fù)載量以及改性DBB在體內(nèi)促進(jìn)骨再生的作用如何,課題組將在本實驗的基礎(chǔ)上做進(jìn)一步研究。

本研究運用仿生磷酸鈣涂層技術(shù)對DBB進(jìn)行改性,將ICA負(fù)載到DBB表面的磷酸鈣涂層中,檢測ASCs在材料上的附著及成骨分化,結(jié)果表明改性DBB具有良好的生物相容性及骨誘導(dǎo)性,有望為口腔臨床骨再生手術(shù)提供理想的骨替代材料。