徐 冰,毛曉娟,付曉亮,舒 濤,楊增悅,王 東*,郭金剛

(1陜西航天醫(yī)院泌尿外科,西安 710025;2渭南市婦幼保健院;3空軍醫(yī)科大學(xué)唐都醫(yī)院泌尿外科;*通訊作者,E-mail:wangdongtangdu@163.com)

腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)屬于泌尿系統(tǒng)腫瘤,在所有腎癌中發(fā)病率最高,且在泌尿系統(tǒng)中發(fā)病率僅次于膀胱癌[1-3]。在世界范圍內(nèi),ccRCC的發(fā)病率及死亡率都呈現(xiàn)快速上升趨勢,嚴(yán)重影響人類的身體健康和生活質(zhì)量[4]。目前ccRCC最有效的治療方法為根治性腎癌切除手術(shù)。約60%的腎透明細(xì)胞癌患者會(huì)發(fā)生病灶轉(zhuǎn)移,發(fā)生病灶轉(zhuǎn)移的患者在接受上述方式治療后仍有約30%的患者發(fā)生復(fù)發(fā)病灶轉(zhuǎn)移現(xiàn)象,并且發(fā)生病灶轉(zhuǎn)移的患者生存率非常低[5]。目前關(guān)于ccRCC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究非常少,深入探索ccRCC的分子機(jī)制可以為其治療或診斷提供重要的理論基礎(chǔ)。

近年來,越來越多的研究顯示,微小RNAs(microRNAs,miRNAs)可通過調(diào)控功能基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)水平,參與調(diào)控多種細(xì)胞生命過程,其中包括細(xì)胞的新陳代謝、增殖、分化以及凋亡等,并且在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中,miRNAs發(fā)揮重要的調(diào)控作用[6,7]。本研究表明:miR-218可通過調(diào)控NOVA1的表達(dá)抑制腎透明細(xì)胞癌發(fā)展的進(jìn)程,這為了解ccRCC的發(fā)病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑

HK-2、Caki-1和Caki-2細(xì)胞系購于上海繼和生物科技有限公司,NOVA1、GAPDH、U6、miR-128等引物由生工生物工程(上海)有限公司合成;KSFM培養(yǎng)基購于上海博升生物科技有限公司;McCoy’s 5A培養(yǎng)基購于生工生物工程(上海)有限公司;胎牛血清、Trizol和Lipofectamine2000脂質(zhì)體購自美國Invitrogen公司;mRNA、miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Power SYBR Green PCR Master Mix均購于美國Gibco公司;Matrigel膠購于美國BD公司;NOVA1、GAPDH抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗均購于美國Santa公司;DharmaFECT Duo試劑、RIPA裂解液、ECL試劑均購于上海寶賽生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

本研究以正常人腎上皮細(xì)胞HK-2細(xì)胞系和腎透明細(xì)胞系Caki-1、Caki-2等作為研究模型,利用KSFM培養(yǎng)基培養(yǎng)HK-2細(xì)胞,利用McCoy’s 5A培養(yǎng)基培養(yǎng)Caki-1和Caki-2細(xì)胞,培養(yǎng)基中均含有10%胎牛血清以及濃度為100 μmol/ml鏈霉素/青霉素。將加入培養(yǎng)基的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h,挑選生長狀態(tài)優(yōu)良的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

NC miRNA、miR-128 mimic、miR-128 inhibitor、siNOVA1均于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司購買,利用Lipofectamine2000脂質(zhì)體與上述合成的核酸片段混合,按使用說明書轉(zhuǎn)染Caki-1或Caki-2細(xì)胞系,轉(zhuǎn)染后于培養(yǎng)箱中以正常細(xì)胞培養(yǎng)方式繼續(xù)培養(yǎng)24 h,利用RT-qPCR檢測分析細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。

1.4 細(xì)胞總RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

利用消毒無菌離心管收集培養(yǎng)的細(xì)胞,離心棄去上清,吸取1 ml Trizol試劑加入至離心管中,振蕩器上劇烈震蕩1 min;震蕩結(jié)束后向離心管中加入200 μl預(yù)冷氯仿再次震蕩,冰上靜置5 min;4 ℃ 13 000 r/min離心10 min;將上清液轉(zhuǎn)移至新的無菌無RNA酶污染的離心管中,加入1/2上清液體積的預(yù)冷異丙醇,上下顛倒混勻,-20 ℃靜置10 min;再次于低溫高速離心機(jī)中以同樣轉(zhuǎn)速離心10 min,棄去上清;加入預(yù)冷的75%乙醇,離心機(jī)中離心1 min棄去上清,重復(fù)1次;吸除并吹干乙醇,利用30 μl RNase free水溶解并混勻;超微量分光光度計(jì)檢測細(xì)胞總RNA OD260/280以及核酸濃度,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

利用M-MLV和TaqMan microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒分別合成mRNA和miRNA,操作步驟參考試劑盒說明書,細(xì)胞總RNA用量為1 μg;隨后利用Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進(jìn)行mRNA或miRNA相對(duì)表達(dá)量檢測。檢測程序設(shè)定為:95 ℃,10 s;55 ℃,15 s;72 ℃,30 s;45個(gè)循環(huán)。mRNA內(nèi)參為GAPDH,miRNA內(nèi)參為U6。

1.5 細(xì)胞增殖(MTT)實(shí)驗(yàn)

首先按照1.2細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)待檢測細(xì)胞系,利用胰蛋白酶酶解為單細(xì)胞,并充分懸浮,將細(xì)胞懸液接種于96孔板中,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,將培養(yǎng)的細(xì)胞置于全自動(dòng)熒光酶標(biāo)儀中,以波長490 nm檢測細(xì)胞懸液的吸光值。

1.6 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞培養(yǎng)所用試劑以及ThinCert細(xì)胞培養(yǎng)器均置于37 ℃條件下溫浴;以正常細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長期,胰蛋白酶消化細(xì)胞,消化結(jié)束以PBS及無血清培養(yǎng)基分別洗滌1次,并用無血清培養(yǎng)基懸浮,使細(xì)胞懸液濃度約為2×105個(gè)/ml;于下室(24孔板底部)中加入700 μl含有10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基,上室中加入100 μl待檢測細(xì)胞懸浮液,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,擦除上室未發(fā)生侵襲的細(xì)胞,將發(fā)生侵襲的細(xì)胞利用1%結(jié)晶紫試劑染色,于倒置顯微鏡下記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果并統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測

利用干凈無菌10 ml離心管收集待檢測細(xì)胞,每種細(xì)胞的數(shù)目約為(1-5)×106個(gè)/ml,于離心機(jī)中以600 r/min離心5 min,將培養(yǎng)液棄除;將收集的細(xì)胞利用孵育緩沖液洗滌1次,再次600 r/min離心5 min,棄除洗滌液;加入0.1 ml標(biāo)記試劑并重懸細(xì)胞,室溫避光孵育15 min,于離心機(jī)中600 r/min離心5 min,棄上清并用孵育緩沖液洗滌1次,加入Annexin/PI雙染熒光試劑,置于4 ℃避光孵育20 min,每隔4 min震蕩1次;利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡,激發(fā)波長為488 nm,FITC熒光檢測波長為515 nm,PI熒光檢測波長大于560 nm,記錄并統(tǒng)計(jì)檢測結(jié)果。

1.8 結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測

利用microRNA.org-Targets and Expression(http://34.236.212.39/microrna/microrna/getGeneForm.do)和Target Scan Human 7.1(http://www.targetscan.org/vert-71/)預(yù)測分析miR-128的靶向調(diào)控基因,并利用上述分析數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-128與靶基因的結(jié)合位點(diǎn)。

1.9 雙熒光素酶報(bào)告載體構(gòu)建及活性檢測

雙熒光素酶報(bào)告載體為pmirGLO載體,將NOVA1與miR-128預(yù)測的3′-UTR靶點(diǎn)序列(NOVA1 WT 3′-UTR)或突變序列的3′-UTR(NOVA1 MT 3′-UTR)構(gòu)建于上述載體。NOVA1 3′-UTR突變序列以正常序列為模板,對(duì)結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域進(jìn)行點(diǎn)突變。將構(gòu)建的不同載體分別與NC miRNA、miR-128 mimic或miR-128 inhibitor共轉(zhuǎn)染待檢測細(xì)胞,轉(zhuǎn)染試劑為DharmFECT Duo,以正常細(xì)胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后利用Dual-Glo luciferase系統(tǒng)檢測細(xì)胞熒光素酶活性并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.10 蛋白質(zhì)提取定量及Western blot檢測

以方法1.2培養(yǎng)Caki-1或Caki-2細(xì)胞,培養(yǎng)結(jié)束收集細(xì)胞,利用RIPA裂解細(xì)胞,加入裂解液后混合均勻并置于冰上孵育20 min;隨后于低溫高速離心機(jī)中13 000 r/min離心20 min,取上清繼續(xù)實(shí)驗(yàn);利用BCA方法檢測細(xì)胞總蛋白濃度。將待檢測蛋白與加樣緩沖液充分混勻并于100 ℃變性,利用SDS-PAGE分離目的蛋白;電泳結(jié)束后于轉(zhuǎn)膜緩沖液中將目的蛋白電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜上;將含目的蛋白的PVDF膜置于含5%脫脂奶粉的封閉液中,室溫中處理1 h;將一抗NOVA1抗體稀釋500倍后孵育含目的蛋白的PVDF膜,4 ℃條件中孵育過夜;棄去或收集一抗,TBST緩沖液洗滌3次;室溫條件下,以終濃度為稀釋5 000倍的IgG標(biāo)記羊抗兔二抗孵育1 h;棄去二抗,TBST緩沖液洗滌3次,洗滌結(jié)束后加入ECL顯影液,顯影系統(tǒng)中顯影拍照并記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),GAPDH作為內(nèi)參。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本文所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS19.0。利用單因素方差分析(ANOVA)和Student’st檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)并分析數(shù)據(jù)間差異。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎臟正常上皮細(xì)胞與ccRCC細(xì)胞中miR-128的表達(dá)差異

在多種腫瘤細(xì)胞中,miR-128表達(dá)異常,并參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程,為了研究miR-128在ccRCC發(fā)生發(fā)展過程中的生物學(xué)功能,首先分析miR-128在ccRCC細(xì)胞系中的表達(dá)變化。結(jié)果顯示,與腎臟正常上皮細(xì)胞HK-2組相比,miR-128在Caki-1和Caki-2細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著下降(P<0.05,見圖1)。

與HK-2細(xì)胞相比,*P<0.05圖1 miR-128在ccRCC細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)Figure 1 Relative expression of miR-128 in ccRCC cells

2.2 miR-128對(duì)ccRCC細(xì)胞增殖和侵襲的影響

根據(jù)上述結(jié)果可知,miR-128在ccRCC細(xì)胞中表達(dá)異常,為了深入研究miR-128對(duì)ccRCC發(fā)生發(fā)展的影響,本研究將miRNA-NC、miR-128 mimic或miR-128 inhibitor分別轉(zhuǎn)染Caki-1和Caki-2細(xì)胞,了解miR-128對(duì)ccRCC細(xì)胞增殖及侵襲的影響。首先利用RT-qPCR檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染后miR-128的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,與miRNA-NC轉(zhuǎn)染組相比,miR-128 mimic轉(zhuǎn)染組Caki-1和Caki-2細(xì)胞中miR-128相對(duì)表達(dá)水平都顯著上調(diào)(P<0.01),miR-128 inhibitor轉(zhuǎn)染組相對(duì)表達(dá)水平都顯著下調(diào)(P<0.05,見圖2A)。再利用MTT檢測miR-128表達(dá)水平變化對(duì)細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果顯示,與miRNA-NC轉(zhuǎn)染組相比,miR-128 mimic轉(zhuǎn)染組Caki-1和Caki-2細(xì)胞增殖率都顯著下降(P<0.05),miR-128 inhibitor轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖率都顯著上升(P<0.01,見圖2B)。利用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測miR-128表達(dá)水平變化對(duì)細(xì)胞侵襲的影響,結(jié)果顯示,與miRNA-NC轉(zhuǎn)染組相比,miR-128 mimic轉(zhuǎn)染組每個(gè)視野中Caki-1和Caki-2細(xì)胞侵襲數(shù)量都顯著下降(P<0.05),miR-128 inhibitor轉(zhuǎn)染組細(xì)胞侵襲數(shù)量都顯著上升(P<0.05,見圖3)。

與miRNA-NC組相比,*P<0.05,**P<0.01圖2 miR-128抑制ccRCC細(xì)胞增殖Figure 2 The miR-128 inhibited the proliferation of ccRCC cells

2.3 miR-128對(duì)ccRCC細(xì)胞凋亡的影響

在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中,細(xì)胞凋亡的變化也是一個(gè)非常重要的研究指標(biāo),當(dāng)細(xì)胞正常凋亡發(fā)生紊亂時(shí)可引起細(xì)胞惡性增殖,促進(jìn)癌癥進(jìn)程,因此本研究分析了miR-128對(duì)ccRCC細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示,與miRNA-NC轉(zhuǎn)染組相比,miR-128 mimic轉(zhuǎn)染組Caki-1和Caki-2細(xì)胞凋亡率都顯著升高(P<0.01),miR-128 inhibitor轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率都顯著下降(P<0.05,見圖4)。

2.4 miR-128靶向調(diào)控NOVA1

在細(xì)胞中,miRNAs主要通過調(diào)控功能基因的表達(dá)水平影響細(xì)胞的生命過程,miRNAs為單鏈核苷酸并且一般不能編碼蛋白,成熟的miRNAs一般與靶向調(diào)控基因的3′-末端非編碼(UTR)區(qū)含有6-8互補(bǔ)核苷酸序列。因此本研究利用生物信息學(xué)預(yù)測分析成熟miR-128的潛在靶向調(diào)控基因及其調(diào)控結(jié)合位點(diǎn),結(jié)果顯示,在NOVA1 mRNA的3′-UTR區(qū)域含有6個(gè)連續(xù)核苷酸序列與成熟miR-128互補(bǔ)(見圖5)。因此本研究構(gòu)建了NOVA1基因3′-UTR野生型(WT-UTR)和3′-UTR突變(MT-UTR)熒光素酶報(bào)告載體,驗(yàn)證上述序列是否為miR-128的直接靶向調(diào)控位點(diǎn),結(jié)果顯示,在NOVA1 WT-UTR熒光素酶報(bào)告載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中,與miRNA-NC轉(zhuǎn)染組相比,miR-128 mimic轉(zhuǎn)染組細(xì)胞熒光素酶活性明顯下降(P<0.05),而miR-128 inhibitor轉(zhuǎn)染組細(xì)胞熒光素酶活性上升(P<0.05,見圖6)。在NOVA1 MT-UTR熒光素酶報(bào)告載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中,與NC轉(zhuǎn)染組相比,miR-128 mimic轉(zhuǎn)染組細(xì)胞熒光素酶活性無顯著性差異(P>0.05),miR-128 inhibitor轉(zhuǎn)染組細(xì)胞熒光素酶活性也無顯著性差異(P>0.05)。

與miRNA-NC組相比,*P<0.05圖6 miR-128抑制NOVA1活性Figure 6 The miR-128 inhibited the activity of NOVA1

2.5 miR-128對(duì)NOVA1表達(dá)的影響

根據(jù)2.3研究結(jié)果得出,NOVA1可能受miR-128的靶向表達(dá)調(diào)控,本研究利用RT-qPCR和Western blot驗(yàn)證上述研究結(jié)果。利用miRNA-NC、miR-128 mimic或miR-128 inhibitor分別轉(zhuǎn)染Caki-1或Caki-2細(xì)胞,并檢測兩細(xì)胞系中NOVA1表達(dá)變化,結(jié)果顯示,與miRNA-NC轉(zhuǎn)染組相比,miR-128 mimic轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中NOVA1的mRNA(見圖7)和蛋白表達(dá)水平(見圖8)都顯著下降(P<0.05),而miR-128 inhibitor轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中NOVA1的mRNA(見圖7)和蛋白表達(dá)水平(見圖8)都顯著上升(P<0.01)。

與miRNA-NC組相比,*P<0.05,**P<0.01圖7 miR-128抑制NOVA1 mRNA的表達(dá)Figure 7 The miR-128 inhibited the mRNA expression of NOVA1

1.miRNA-NC;2.miR-128 mimic;3.miR-128 inhibitor;與miRNA-NC組相比,*P<0.05,**P<0.01圖8 miR-128抑制NOVA1蛋白表達(dá)Figure 8 The miR-128 inhibited the protein expression of NOVA1

2.6 NOVA1對(duì)ccRCC細(xì)胞增殖和侵襲的影響

因miRNAs常通過調(diào)控功能基因的表達(dá)影響細(xì)胞的生命過程,上述的研究顯示,NOVA1受miR-128表達(dá)調(diào)控,為了研究miR-128調(diào)控NOVA1對(duì)腎透明細(xì)胞癌的影響,隨后研究了NOVA1對(duì)細(xì)胞增殖和侵襲的影響。采用pc-DNA3.1空載體(control)、pc-DNA3.1/NOVA1(NOVA1)、control siRNA或siNOVA1分別轉(zhuǎn)染Caki-1和Caki-2細(xì)胞。首先檢測NOVA1的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,與control轉(zhuǎn)染組相比,pc-DNA3.1/NOVA1轉(zhuǎn)染組Caki-1和Caki-2細(xì)胞中NOVA1表達(dá)水平都顯著上升(P<0.01);與control siRNA轉(zhuǎn)染組相比,siNOVA1轉(zhuǎn)染組,Caki-1和Caki-2細(xì)胞中NOVA1表達(dá)水平都顯著下降(P<0.05，見圖9)。利用MTT實(shí)驗(yàn)檢測NOVA1對(duì)細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果顯示,與control轉(zhuǎn)染組相比,pc-DNA3.1/NOVA1轉(zhuǎn)染組Caki-1和Caki-2細(xì)胞增殖率都顯著上升(P<0.05);與control siRNA轉(zhuǎn)染組相比,siNOVA1轉(zhuǎn)染組Caki-1和Caki-2細(xì)胞增殖率都顯著下降(P<0.05，見圖10A)。利用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測NOVA1對(duì)細(xì)胞侵襲的影響,結(jié)果顯示,與control轉(zhuǎn)染組相比,pc-DNA3.1/NOVA1轉(zhuǎn)染組Caki-1和Caki-2細(xì)胞侵襲能力都顯著上升(P<0.05);與control siRNA轉(zhuǎn)染組相比,siNOVA1轉(zhuǎn)染Caki-1和Caki-2組細(xì)胞侵襲能力都顯著下降(P<0.05,見圖10B、C)。

1.control;2.NOVA1;3.control siRNA;4.siNOVA1;與control組相比,**P<0.02;與control siRNA組相比,#P<0.05圖9 NOVA1在ccRCC細(xì)胞中的表達(dá)Figure 9 The expression of NOVA1 in ccRCC cells

與control組相比,*P<0.05,**P<0.01;與control siRNA組相比,#P<0.05,##P<0.01圖10 NOVA1調(diào)控ccRCC細(xì)胞增殖及侵襲Figure 10 NOVA1 regulated the proliferation and invasion of ccRCC cells

2.7 NOVA1對(duì)ccRCC細(xì)胞凋亡的影響

隨后研究分析了NOVA1在ccRCC細(xì)胞凋亡過程中的作用,結(jié)果顯示,與control轉(zhuǎn)染組相比,pc-DNA3.1/NOVA1轉(zhuǎn)染組NOVA1過表達(dá)時(shí),Caki-1和Caki-2細(xì)胞系的凋亡率都顯著下降(P<0.05);與control siRNA轉(zhuǎn)染組相比,siNOVA1轉(zhuǎn)染組NOVA1表達(dá)沉默時(shí),Caki-1和Caki-2細(xì)胞系的凋亡率都顯著上升(P<0.01,見圖11)。

與control組相比,*P<0.05;與control siRNA組相比,##P<0.01圖11 NOVA1調(diào)控ccRCC細(xì)胞凋亡Figure 11 NOVA1 regulated the apoptosis of ccRCC cells

3 討論

在人類細(xì)胞中,miRNAs的種類非常多,在miRNAs序列5′末端含有特殊的核苷酸序列,約含6-8個(gè)核苷酸,其可與靶向調(diào)控基因mRNA的3′末端非編碼區(qū)發(fā)生特異結(jié)合,對(duì)靶基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。而miRNAs的合成過程可受某些功能基因的表達(dá)調(diào)控,并且在不同組織和細(xì)胞中,miRNAs序列高度保守,并且miRNAs表達(dá)具有組織特異性,成熟的miRNAs可調(diào)控與多種生命活動(dòng)相關(guān)的信號(hào)途徑[8],同時(shí)可能參與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的調(diào)控,影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程,主要包括腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡等[9-12]。近年來越來越多的研究顯示,不同的miRNAs可調(diào)控同一種腫瘤的發(fā)生發(fā)展,相同的miRNA可能調(diào)控不同腫瘤的進(jìn)程[13]。例如在膀胱癌細(xì)胞中,miR-221、miR-223和miR-26等表達(dá)水平顯著上調(diào)[14];miR-345在結(jié)直腸癌[15]、肝癌[16]、乳腺癌[17]以及前列腺癌[18]等腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常,并調(diào)控上述腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究顯示miR-128在ccRCC細(xì)胞中顯著下調(diào),而目前尚未有miR-128影響ccRCC發(fā)生發(fā)展的報(bào)道。

目前已有研究顯示,miR-128在其他多種腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。Li等[19]報(bào)道顯示miR-128在卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào),并且可引起癌細(xì)胞順鉑耐藥性明顯增強(qiáng),當(dāng)miR-128在卵巢癌細(xì)胞系中過表達(dá)時(shí),可增加細(xì)胞對(duì)順鉑藥物的敏感性,表明調(diào)控卵巢癌細(xì)胞中miR-128的表達(dá)水平可能為治療該疾病的潛在靶點(diǎn)。Sun等[20]研究顯示miR-128在前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著下調(diào),并引起腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑藥物的耐受性上升,當(dāng)miR-128在上述細(xì)胞系中過表達(dá)時(shí)可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑藥物的敏感性,同時(shí)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力也明顯被抑制;在前列腺癌細(xì)胞系中miR-128可靶向抑制ZEB1的表達(dá),當(dāng)ZEB1表達(dá)沉默時(shí)可弱化miR-128表達(dá)下調(diào)引起的前列腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑藥物的耐受性及侵襲能力的上升。Zhao等[21]研究顯示miR-128-3p在食管鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)顯著下調(diào),并與患者較差的預(yù)后相關(guān),其研究顯示miR-128-3p可抑制癌細(xì)胞的遷移和侵襲,根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-128-3p可靶向抑制ZEB1的表達(dá),并且通過調(diào)控ZEB1抑制上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型和代謝。Koh等[22]報(bào)道顯示在肺癌干細(xì)胞中miR-128表達(dá)水平顯著下調(diào),而BMI-1和MUC1-C表達(dá)水平異常上調(diào);當(dāng)miR-128在肺癌干細(xì)胞系中過表達(dá)時(shí)BMI-1和MUC1-C表達(dá)水平顯著下調(diào),雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示miR-128可抑制MUC1熒光素酶活性,miR-128過表達(dá)可顯著抑制癌細(xì)胞的增殖、新陳代謝活性、自我更新、遷移、侵襲和集落形成,并且可明顯促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡。本研究顯示miR-128在ccRCC細(xì)胞中的表達(dá)水平異常下調(diào),當(dāng)ccRCC細(xì)胞中miR-128過表達(dá)時(shí)可抑制細(xì)胞的增殖和侵襲,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡;而ccRCC細(xì)胞中miR-128表達(dá)沉默時(shí)細(xì)胞增殖和侵襲能力顯著上升,細(xì)胞凋亡率明顯下降。

在細(xì)胞中,miRNAs一般通過調(diào)控功能基因的表達(dá)影響細(xì)胞的生命活動(dòng)。在腫瘤細(xì)胞中,miRNAs通常調(diào)控與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)腫瘤進(jìn)程。如miR-150通過調(diào)控MYB表達(dá)影響乳腺癌或結(jié)直腸癌的進(jìn)程[23],miR-339-5p通過靶向調(diào)控MDM2表達(dá)影響腎癌和結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展[24]。本研究中,生物信息學(xué)分析和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示,miR-128與NOVA1 3′-UTR具有特異性結(jié)合位點(diǎn),miR-128可抑制NOVA1活性,通過RT-qPCR和Western blot驗(yàn)證顯示,miR-128可抑制ccRCC細(xì)胞中NOVA1的表達(dá)水平。

NOVA1為一種具有特異性序列的RNA結(jié)合蛋白,該蛋白有3個(gè)KH型結(jié)構(gòu)域可與RNA結(jié)合,NOVA1與RNA結(jié)合的特殊位點(diǎn)中含有YCAY(Y為嘧啶)重復(fù)序列。近年來多項(xiàng)研究顯示NOVA1參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程,而尚未有報(bào)道NOVA1在ccRCC發(fā)生發(fā)展中的作用。Zhang等[25]研究顯示NOVA1在原發(fā)性肝癌中發(fā)揮致癌作用,當(dāng)NOVA1表達(dá)上調(diào)時(shí)可促進(jìn)裸鼠原發(fā)性癌進(jìn)程,免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示NOVA1與GABAARγ2相互作用。Yoon等[26]研究顯示NOVA1在胃癌組織中表達(dá)顯著下調(diào),低表達(dá)水平的NOVA1與胃癌患者預(yù)后較差有密切聯(lián)系,并且在胃癌細(xì)胞系中NOVA1的表達(dá)水平也顯著下調(diào),其表達(dá)受miR-146b-5p靶向調(diào)控。Shen等[27]報(bào)道顯示miR-339在人胃癌細(xì)胞中調(diào)控NOVA1表達(dá)影響胃癌進(jìn)程,miR-339可抑制胃癌的增殖和侵襲,而NOVA1表達(dá)上調(diào)時(shí)可逆轉(zhuǎn)miR-339過表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用。Zhi等[28]研究顯示NOVA1在星形細(xì)胞瘤中受miR-181b-5p表達(dá)調(diào)控,在該腫瘤細(xì)胞中NOVA1表達(dá)水平顯著上升,并促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲,抑制細(xì)胞凋亡;當(dāng)miR-181b-5p在星形細(xì)胞瘤中過表達(dá)時(shí)NOVA1表達(dá)顯著下調(diào),細(xì)胞增殖和侵襲受抑制,細(xì)胞凋亡率明顯上升。而本研究顯示NOVA1在ccRCC細(xì)胞系中過表達(dá)時(shí),細(xì)胞增殖和侵襲能力顯著上升,細(xì)胞凋亡率顯著下降;而NOVA1在ccRCC細(xì)胞系中表達(dá)沉默時(shí),細(xì)胞增殖和侵襲能力被抑制,并且腫瘤細(xì)胞凋亡率明顯上升。此外,本研究顯示miR-128與NOVA1具有靶向結(jié)合位點(diǎn),通過雙熒光素酶報(bào)告分析表明miR-128可靶向調(diào)控NOVA1在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá),miR-128過表達(dá)可顯著抑制NOVA1表達(dá),miR-128表達(dá)水平下降時(shí),NOVA1在上述細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著上升,NOVA1表達(dá)水平的變化可顯著調(diào)控腎透明細(xì)胞癌的增殖、侵襲和細(xì)胞凋亡。

綜上,miR-128可通過靶向調(diào)控NOVA1的表達(dá)抑制ccRCC細(xì)胞的增殖和侵襲,并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。本研究顯示,miR-128表達(dá)下調(diào)時(shí)可解除對(duì)NOVA1表達(dá)的抑制作用,從而促進(jìn)ccRCC細(xì)胞的增殖和侵襲,并抑制細(xì)胞的凋亡。本文研究結(jié)果為ccRCC的分子機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ),也為ccRCC的治療研究提供潛在治療靶點(diǎn)。