徐傳慧，潘 昕，李超峰，張大光*

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院)

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨變性及破壞為主要特征的常見病和多發(fā)病，超過50%的65歲以上老年人受OA病痛折磨[1]。最近的研究顯示在OA的病理過程中ATAMTS-5、Syndecan-4，MMP-13，Aggrecan及collagen II和軟骨代謝密切相關(guān)。因此，我們利用ELISA技術(shù)檢測正常人和骨關(guān)節(jié)炎患者血清中的上述軟骨代謝標(biāo)記物的含量和骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)系，找出早期診斷骨關(guān)節(jié)炎的診斷依據(jù)。

1 資料與方法

1.1臨床資料

本研究共納入100名實(shí)驗(yàn)對象，按照K-L分級每組20人，平均年齡(45±15歲)。納入標(biāo)準(zhǔn)為年齡在30-60歲；心功能、肝功能、腎功能正常；排除類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、感染性關(guān)節(jié)炎、其他部位骨關(guān)節(jié)炎，其他疾病的關(guān)節(jié)炎患者。所有OA患者診斷符合ACR關(guān)于OA的診斷標(biāo)準(zhǔn)，所有參加實(shí)驗(yàn)者均經(jīng)患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2OA患者程度評估

1.2.1所有患者拍攝標(biāo)準(zhǔn)雙膝關(guān)節(jié)站立位X線片，按照Kellgren和Lawrence的放射學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分組，在癥例報(bào)道書中記錄。分級標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 Kellgren和Lawrence的放射學(xué)診斷分級標(biāo)準(zhǔn)

1.2.2次要評價(jià)項(xiàng)目 (1)患者的VAS；(2)患者的年齡；(3)患者的體重指數(shù)(BMI)。

1.3資料收集

1.3.1一般血液檢查 空腹靜脈血10 ml，測定以下項(xiàng)目，在癥例報(bào)告中記錄。(1)測定時(shí)期：樣本采集后立即;(2)測定項(xiàng)目：血常規(guī)、ESR、CRP;(3)測定方法：檢驗(yàn)科常規(guī)測定方法

1.3.2特殊血液檢查 空腹靜脈血10 ml，所有標(biāo)本用EDTA抗凝試管，采取后置于4°冰箱不超過7天。為了測定準(zhǔn)確，排除技術(shù)原因的誤差，我們指定專人進(jìn)行測試，每例標(biāo)本測定3次。(1)測定時(shí)期：樣本采集后7天之內(nèi)及術(shù)后半年;(2)測定項(xiàng)目:Syndecan-4，MMP-13,ADAMTS-5,Aggrecan,CollagenⅡ、C4S、C6S;(3)主要試劑和儀器：Syndecan-4、MMP-13、ADAMTS-5、C4S、C6S，ELISA試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司，Aggrecan、CollagenⅡELISA試劑盒購自武漢友聯(lián)特生物技術(shù)有限公司。美國Bio-Tek公司ELX800型全自動酶標(biāo)儀。

1.4ELISA法檢測

采用ELISA法檢測Syndecan-4、MMP-13、ADAMTS-5、C4S、C6S、Aggrecan,CollagenⅡ的表達(dá)水平，按照說明書操作，在酶標(biāo)儀450 nm處測得吸光度(A)值。根據(jù)各自標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及A值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得出相應(yīng)的計(jì)算公式，最后代入各個(gè)樣品的A值計(jì)算各個(gè)樣品的表達(dá)水平。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有的結(jié)果都采用SPSS19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，患者血清中Syndecan-4、MMP-13、 ADAMTS-5、C4S、C6S、Aggrecan,CollagenⅡ的表達(dá)水平均以mean±SD表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩因素間相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析，相關(guān)性分為弱(r=0.20-0.39)，中度(r：0.40-0.59)，強(qiáng)(r=0.60-0.79)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1血清生物標(biāo)記物在不同組間中的含量測定100名患者按照X線Kellgren和Lawrence的放射學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分組，其中從正常開始為0級組20人，分別分為Ⅰ級組20人、Ⅱ級組20人、Ⅲ級組20人、Ⅳ級組20人。

2.2骨關(guān)節(jié)炎患者血清中軟骨代謝標(biāo)記物與骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)系見表2，Syndecan-4、MMP-13、ADAMTS-5、CollagenⅡ與關(guān)節(jié)炎程度呈正相關(guān)，其中Syndecan-4的相關(guān)性最高(r值0.714,P值<0.001),其次為MMP-13(r值0.683，P值<0.001)；CollagenⅡ(r值0.632,P值<0.001)。ADAMTS-5(r值0.511,P值<0.003)的相關(guān)性均為中度。C4S(r值-0.546,P值<0.001)、C6S(r值-0.556,P值<0.001)、Aggrecan(r值-0.502,P值<0.003)為負(fù)相關(guān)。

表2 軟骨代謝標(biāo)記物與骨關(guān)節(jié)炎程度的關(guān)系

3 討論

OA是目前中老年人關(guān)節(jié)疼痛及致殘的主要病因，目前的診斷方法無法滿足早期診斷。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，眾多研究者在OA患者血液中檢測到軟骨組織代謝的一些生物分子，發(fā)現(xiàn)這些生物分子與OA的發(fā)病密切相關(guān)，在X線等影像學(xué)出現(xiàn)軟骨明顯退變征象之前，血液中的這些生物分子的濃度即可出現(xiàn)明顯改變，因此被用于OA的診斷、預(yù)后及療效監(jiān)測，所以被稱之為OA生物標(biāo)記物[2]。

最新的研究表明[3,4]，在OA的病理過程中ADAMTS-5，MMP-13在軟骨破壞過程中起到核心作用，他們的分泌增加破壞細(xì)胞外基質(zhì)中的Aggrecan及collagen II，最終導(dǎo)致軟骨變性及破壞。在這個(gè)過程中最新的研究證明Syndecan-4在調(diào)控ADAMTS-5的活性過程中起到關(guān)鍵作用,并且和MMP-13的調(diào)控有關(guān)。

在OA的發(fā)病機(jī)制中MMP-13起到非常關(guān)鍵的作用，這在MMP-13基因缺陷鼠模型得到證實(shí)。在正常的關(guān)節(jié)軟骨中II型膠原蛋白(collagen II)被細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白聚糖(proteoglycan)封閉不能與軟骨細(xì)胞表面的酪氨酸激酶受體(DDR-2)相互作用，但在OA的關(guān)節(jié)軟骨中，細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白聚糖減少，使II型膠原蛋白裸露，使DDR-2的表達(dá)增強(qiáng)，在DDR-2與II型膠原蛋白相互作用下進(jìn)一步加強(qiáng)MMP-13的活性。在這個(gè)過程中使蛋白聚糖(proteoglycan)減少的關(guān)鍵因素是ADAMTS-5,它的表達(dá)與活性受多配體蛋白聚糖-4(syndecan-4)的調(diào)控，這在Syndecan-4缺陷鼠模型中關(guān)節(jié)軟骨的ADAMTS-5的活性降低，不易發(fā)生OA得到證明。這個(gè)過程是在激活素受體樣激酶ALK-1參與下啟動TGF-β信號傳導(dǎo)路完成的[5]。

MMP-13(matrix metalloproteinase 13)，又叫膠原酶3，絕大多數(shù)的研究證明MMP-13在OA關(guān)節(jié)軟骨破壞過程中起到核心作用。Little等2009年利用MMP-13缺乏鼠模型證明MMP-13缺乏鼠關(guān)節(jié)軟骨破壞減少[6]。這個(gè)實(shí)驗(yàn)利用MMP-13缺陷鼠做成DMM(destabilization medial meniscal)OA動物模型，觀察4周和8周時(shí)的病理結(jié)果。結(jié)果在4周時(shí)wild type and MMP-13-/- mice的關(guān)節(jié)軟骨破壞沒有明顯區(qū)別，但在8周時(shí)MMP-13-/- mice關(guān)節(jié)軟骨的破壞明顯輕于wild type mice；Aggrecan在4周就有明顯的減少，在8周的時(shí)候更進(jìn)一步減少，證明了MMP-13減少在Aggrecan缺乏狀態(tài)下能夠抑制關(guān)節(jié)軟骨的破壞。Glasson等2005年在Nature上發(fā)表文章發(fā)現(xiàn)在OA病理過程中關(guān)節(jié)軟骨中的Aggrecan受到破壞主要是由ADAMTS-5造成的[5]。他們利用ADAMTS-5缺乏鼠制作OA動物模型，發(fā)現(xiàn)Aggrecan受到破壞之后使collagen type II裸露，使MMP-13與collagen type II互相作用發(fā)揮作用。這個(gè)過程syndecan-4結(jié)合MMP-3發(fā)揮調(diào)控ADAMTS-5的作用。

配體蛋白聚糖-4(Syndecan-4)是跨細(xì)胞膜表面的硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)，它通過硫酸肝素側(cè)鏈結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)中的各種生長因子和細(xì)胞因子發(fā)揮作用。在軟骨細(xì)胞中它有4種表達(dá)類型，目前研究比較清楚的是Syndecan-4。隨著對Syndecan-4認(rèn)識的逐漸深入，發(fā)現(xiàn)它主要在軟骨細(xì)胞進(jìn)化和分化的過程中起到重要的調(diào)控作用，在病理過程中也具有非常重要的功能[6，7]。在軟骨組織中，它特異性的作用在肥大軟骨細(xì)胞，在OA軟骨中表達(dá)增強(qiáng)，尤其是Syndecan-4在調(diào)控ADAMTS-5活性過程中起到核心作用[4]。在鼠DMM OA模型研究顯示，減少Syndecan-4的表達(dá)可以顯著的減少OA發(fā)生，也同時(shí)被Syndecan-4基因缺陷鼠的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ退C明。在這個(gè)發(fā)現(xiàn)過程中，發(fā)現(xiàn)Syndecan-4調(diào)控ADAMTS-5的活性依賴MMP-3。2008年Kon等的研究發(fā)現(xiàn)Syndecan-4保護(hù)OPN (osteopontin)調(diào)控的急性肝臟損傷[8]，2009年Matsui利用OPN基因缺陷鼠OA模型研究中發(fā)現(xiàn)Syndecan-4和MMP-13活性有關(guān)[9]。這個(gè)研究發(fā)現(xiàn)在退行性O(shè)A和創(chuàng)傷性O(shè)A的關(guān)節(jié)軟骨中均缺乏OPN，OPN在OA病理過程中是保護(hù)性因素，在OA的病理過程中Syndecan-4抑制OPN的表達(dá)，調(diào)控MMP-13活性增強(qiáng)，MMP-13主要分解關(guān)節(jié)軟骨中的type II collagen。因此得出結(jié)論，OPN在OA病理過程中起到非常關(guān)鍵的作用，并且和MMP-13一起相互作用使蛋白聚糖減少。2011年Shi等報(bào)道在平滑肌細(xì)胞中Syndecan通過FAK-ERK系統(tǒng)調(diào)控MMP-13的表達(dá)[10]。

在本次研究的血清中軟骨代謝標(biāo)記物結(jié)果中，Syndecan-4、MMP-13、ADAMTS-5、CollagenⅡ、C4S、C6S、Aggrecan與骨關(guān)節(jié)炎患者骨關(guān)節(jié)炎病變程度存在著不同程度的相關(guān)性。其中Syndecan-4、MMP-13、CollagenⅡ，可作為骨關(guān)節(jié)炎早期診斷的輔助檢查項(xiàng)目，CollagenⅡ、C4S、C6S可反映出骨關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度。