付 偉 謝 東 班春梅 曹 潔 王 松 鄧婭婕

中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第925醫(yī)院消化血液科(550009)

背景：幽門螺桿菌(Hp)感染與慢性胃炎、十二指腸潰瘍、胃癌以及多種胃腸外疾病相關(guān)，然而其分子致病機(jī)制及其與宿主間的相互作用尚不明確。目的：基于miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為闡明Hp與宿主間的相互作用以及Hp感染可能造成的病變提供線索。方法：使用GEO數(shù)據(jù)集篩選Hp感染相關(guān)miRNAs和mRNAs，檢索差異表達(dá)miRNAs的靶基因并與差異表達(dá)mRNAs取交集以構(gòu)建miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對(duì)靶基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，分析Hp感染與疾病的相關(guān)性。結(jié)果：靶基因功能富集分析顯示富集最顯著的基因集為趨化因子受體結(jié)合趨化因子。蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中共有28個(gè)核心基因，疾病連接性分析顯示Hp感染與癌癥以及消化、神經(jīng)、心血管、呼吸、免疫系統(tǒng)疾病相關(guān)。結(jié)論：本研究提供了一種基于miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)預(yù)測病原體與人類疾病相關(guān)性的方法，并發(fā)現(xiàn)Hp感染可增加多種胃腸外疾病風(fēng)險(xiǎn)。

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori, Hp)是一種革蘭陰性致病菌，長期攜帶Hp可顯著增加慢性胃炎、十二指腸潰瘍、胃腺癌和胃黏膜相關(guān)淋巴樣組織淋巴瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，并與多種胃腸外疾病相關(guān)[1]。然而Hp感染的分子致病機(jī)制及其與宿主間的相互作用迄今尚未完全明確。

基因轉(zhuǎn)錄失調(diào)在人類疾病中起有重要作用，而微RNA(microRNAs, miRNAs)通過在轉(zhuǎn)錄后水平下調(diào)靶基因表達(dá)，在諸多生理和病理過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[2]。因此Hp感染相關(guān)miRNAs及其靶基因的鑒定可能為相關(guān)分子致病機(jī)制的認(rèn)識(shí)提供新的見解。高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫Gene Expression Omnibus(GEO; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)是一個(gè)可以儲(chǔ)存和發(fā)布高通量微陣列以及其他形式功能基因組數(shù)據(jù)的公共存儲(chǔ)庫[3]。本研究通過從GEO數(shù)據(jù)集中鑒定Hp感染相關(guān)miRNAs及其靶mRNAs，構(gòu)建miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期為闡明Hp與宿主之間的相互作用以及Hp感染可能造成的病變提供線索。

材料與方法

一、GEO數(shù)據(jù)集

本研究使用的GEO數(shù)據(jù)集為GSE19769和GSE5081，前者為10例Hp陰性和9例Hp陽性人胃黏膜標(biāo)本的miRNAs微陣列數(shù)據(jù)，后者為16例Hp陰性和16例Hp陽性糜爛胃黏膜與鄰近正常胃黏膜標(biāo)本的全基因組寡核苷酸微陣列數(shù)據(jù)。

二、方法

1. 篩選差異表達(dá)miRNAs和mRNAs：采用GEO2R對(duì)所有表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[4]。調(diào)整P值默認(rèn)使用Benjamini和Hochberg(錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率)方法以降低假陽性率。MiRNAs數(shù)據(jù)集cut-off值設(shè)定為調(diào)整后P<0.05且|log10FC|>2；mRNAs數(shù)據(jù)集cut-off值設(shè)定為調(diào)整后P<0.05且|log10FC|>1.5。使用MeV 4.9通用微陣列分析工具進(jìn)行差異表達(dá)的分層聚類并可視化。

2. MiRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：從DIANA-TarBase 8.0中檢索差異表達(dá)miRNAs的靶基因[5]，并與mRNAs數(shù)據(jù)集中的差異表達(dá)基因取交集。使用Cytoscape 3.6.1生物信息分析軟件產(chǎn)生miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[6]。

3. GO(Gene Ontology)、KEGG(Kyoto Encyclopedia Genes and Genomes)富集分析和蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：使用Metascape對(duì)Hp感染相關(guān)miRNAs靶基因進(jìn)行GO功能和KEGG信號(hào)通路富集分析。使用STRING 10.0構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，cut-off值設(shè)定為置信評(píng)分≥0.9[7]，Cytoscape 3.6.1進(jìn)行可視化，CentiScaPe 2.2進(jìn)行生物網(wǎng)絡(luò)分析，計(jì)算節(jié)點(diǎn)屬性，degree>20閾值鑒定為核心基因[8]。

4. Hp感染與疾病相關(guān)性分析：使用比較毒理基因組數(shù)據(jù)庫(Comparative Toxicogenomics Database)“set analyzer”工具鑒定與Hp感染相關(guān)基因相關(guān)的疾病[9]，cut-off值設(shè)定為Bonferroni校正P<0.05，P值越小，基因與疾病之間的連接越可靠。

結(jié) 果

一、Hp感染相關(guān)miRNAs和mRNAs

對(duì)GEO數(shù)據(jù)集GSE19769、GSE5081的分析分別鑒定出42個(gè)差異表達(dá)miRNAs和633個(gè)差異表達(dá)mRNAs(圖1)。

二、MiRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

42個(gè)Hp感染相關(guān)miRNAs從TarBase數(shù)據(jù)庫中共獲得10 617個(gè)靶基因，經(jīng)與Hp感染相關(guān)mRNAs交集，最終獲得194個(gè)靶基因。MiR-153-5p靶基因最多，共52個(gè)，miR-95-5p、miR-577、miR-548b-5p、miR-519e-5p亦均調(diào)控10個(gè)以上靶基因。MiRNAs對(duì)靶基因的調(diào)控為下調(diào)其表達(dá)，根據(jù)基因表達(dá)上調(diào)或下調(diào)建立關(guān)系圖(圖2)，圖中122個(gè)靶基因可能每列包含來自特定基因的數(shù)據(jù)，每行包含來自單個(gè)樣本的數(shù)據(jù)；紅色為上調(diào)，綠色為下調(diào)在Hp定植和持續(xù)感染中發(fā)揮重要作用。

圖1 Hp感染相關(guān)miRNAs(A)和mRNAs(B)的鑒定(微陣列分析熱圖)

長方形和橢圓形為基因，菱形為miRNAs(紅色為上調(diào)，綠色為下調(diào))；與miR-153-5p(圖中左上方環(huán)形中心)相關(guān)性最強(qiáng)的36個(gè)靶基因?yàn)閃WC1、UTP23、UQCC1、TTL、TRPM3、TRDN、SPAG16、SLC8A1、SFSWAP、SAMD12、RAB39B、PPP1R16B、PMP2、NIN、NETO1、NALCN、MYEF2、MSR1、MS4A1、MC2R、LPCAT1、KLHL6、KLF12、KIAA0408、KCTD16、KCNN3、KCND3、HMGA2、GPNMB、FCRL4、FAM65B、EPHA3、ELOVL2、CYP7A1、CDH13、ALDOB

三、MiRNA靶基因功能富集分析

對(duì)Hp感染相關(guān)miRNAs靶基因進(jìn)行GO-BP、KEGG途徑富集分析，富集最顯著的基因集為趨化因子受體結(jié)合趨化因子(R-HSA-380108)和金屬離子內(nèi)穩(wěn)態(tài)(GO:0055065)(圖3A)。此外，分析還顯示Hp感染與免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)信號(hào)通路(GO:0002764)、腎單位發(fā)育(GO:0072006)等有關(guān),各基因集之間呈現(xiàn)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系(圖3B)。

四、Hp感染與疾病的相關(guān)性

圖1中Hp感染相關(guān)miRNAs靶基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)見圖4。28個(gè)核心基因的疾病連接性分析顯示Hp感染與包括癌癥以及消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管、呼吸道和免疫系統(tǒng)疾病在內(nèi)的48種人類疾病相關(guān)。

討 論

本研究利用GEO數(shù)據(jù)集GSE19769、GSE5081篩選Hp感染相關(guān)miRNAs和mRNAs，并基于Tarbase數(shù)據(jù)庫構(gòu)建miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示miR-153-5p、miR-95-5p、miR-577、miR-548b-5p、miR-519e-5p為中心miRNAs，其中miR-153-5p靶基因最多，圖2網(wǎng)絡(luò)中列出了與之相關(guān)性最強(qiáng)的36個(gè)靶基因。MiR-153-5p、miR-95-5p、miR-577等原則上可作為診斷性生物學(xué)標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。既往研究發(fā)現(xiàn)，胃

癌組織中miR-153表達(dá)下調(diào)，其靶基因Snail表達(dá)上調(diào)，從而介導(dǎo)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移[10]；此外，miR-153在胃癌中還參與了超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子Uc.416+A的調(diào)節(jié)，進(jìn)而可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長[11]。Hsa-miR-95在胃印戒細(xì)胞癌中表達(dá)下調(diào)，在腸型胃腺癌中表達(dá)上調(diào)，可能與印戒細(xì)胞癌的高侵襲轉(zhuǎn)移性和化療耐藥密切相關(guān)[12]。而受這些miRNAs調(diào)控的靶基因在Hp感染和相關(guān)疾病發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中可能亦發(fā)揮重要生物學(xué)作用。靶基因功能富集分析顯示富集最顯著的基因集為趨化因子受體結(jié)合趨化因子和金屬離子內(nèi)穩(wěn)態(tài)，而一些先前未被重視的生物過程和途徑亦可能與Hp感染有關(guān)。

根據(jù)degree閾值鑒定得到28個(gè)核心基因(IL8、KNG1、PTPRC、CXCL10、CXCR5、CCL19、CCR7、CD19、CXCL9、C3、CXCL13、CXCL1、CCL20、CXCL2、AGTR2、CCR4、CD79A、CXCL11、CXCL3、CXCL5、SSTR5、CXCL6、HCAR3、P2RY13、PNOC、PTGER3、TAS2R14、CDC42)，圖形體積越大，degree閾值越高

A：Hp感染相關(guān)miRNAs靶基因Metascape途徑富集分析的前20個(gè)簇，條形長度為每個(gè)聚類中最佳評(píng)分項(xiàng)的log10(P)；B：Metascape分析前20個(gè)聚類富集項(xiàng)之間的關(guān)系(相同顏色的節(jié)點(diǎn)屬于同一個(gè)群集)

共28個(gè)基因被確定為Hp感染相關(guān)miRNAs靶基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的核心基因，包括白細(xì)胞介素-8(IL-8)以及一系列趨化因子受體和配體。IL-8作為一種炎癥細(xì)胞因子，可由Hp感染誘導(dǎo)表達(dá)，并與胃癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[13]。人胃上皮細(xì)胞定植的Hp經(jīng)Toll樣受體2(TLR2)識(shí)別，可誘導(dǎo)CXCL1、CXCL5、CXCL8等趨化因子表達(dá)[14]。仍有一些核心基因如KNG1的功能尚未確定，為未來Hp感染的研究提供了新的方向。

對(duì)上述28個(gè)核心基因的疾病連接性分析顯示Hp感染與癌癥以及消化、神經(jīng)、心血管、呼吸、免疫系統(tǒng)疾病相關(guān)，與既往研究結(jié)果相符[15-18]。當(dāng)前證據(jù)支持微生物失調(diào)在人類疾病中發(fā)揮重要的信使作用，Hp感染可能的致病機(jī)制包括分子模擬、慢性炎癥、損傷DNA等，其不僅直接損傷宿主細(xì)胞，而且可損傷黏膜屏障、改變消化道微生物群。

綜上所述，本研究嘗試了通過構(gòu)建miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)預(yù)測病原體與人類疾病相關(guān)性的新方法，并發(fā)現(xiàn)Hp感染可增加多種胃腸外疾病風(fēng)險(xiǎn)，相關(guān)核心基因的鑒定可能為未來研究提供方向。