李志學(xué)，梁子涵，賈承霖，漆宇騁，岳俊杰，郭志云

1.西南交通大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都610031；2.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京100071

肺癌在世界范圍的發(fā)病率和致死率都高居各類癌癥之首，分別達(dá)11.6%和18.4%[1]。肺癌分為小細(xì)胞癌和非小細(xì)胞癌，非小細(xì)胞癌又分為鱗狀細(xì)胞癌、腺細(xì)胞癌等亞型，其中肺腺癌最為常見(jiàn)。肺腺癌治療方法主要包括手術(shù)、放療、化療和靶向治療，但僅靠這些療法還無(wú)法保證徹底治愈[2]。因此，關(guān)于肺腺癌發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制及調(diào)控機(jī)理的研究，仍是學(xué)術(shù)界關(guān)注的熱點(diǎn)。

在人類進(jìn)化演變的過(guò)程中，形成了紛繁復(fù)雜又高度有序的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控結(jié)構(gòu)，它們由一定的模序（motif）元件所構(gòu)成，在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的基因調(diào)節(jié)作用[3]。其中，前饋環(huán)路（feed-for?ward loops，F(xiàn)FLs）是一種重要的循環(huán)線性模序，它由2個(gè)輸入調(diào)節(jié)因子P1和P2，以及1個(gè)輸出因子P3 構(gòu)成。P1 可以調(diào)節(jié)P2，也可以與P2 共同調(diào)節(jié)P3，即P3 所受到的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)的影響是P1、P2 元件綜合作用的結(jié)果。

增強(qiáng)子是真核細(xì)胞中普遍存在的順式調(diào)控元件，可以通過(guò)招募轉(zhuǎn)錄因子（transcription fac?tor，TF），進(jìn)而結(jié)合多種激活因子，形成多蛋白復(fù)合物，使染色質(zhì)成環(huán)，遠(yuǎn)端調(diào)控啟動(dòng)子。通過(guò)對(duì)增強(qiáng)子染色質(zhì)的修飾和重塑等作用，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄[4]。此外，較多證據(jù)表明，增強(qiáng)子與microRNA（miRNA）間同樣存在復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系。Xiao 等[5]通過(guò)刪除HEK293T細(xì)胞系中的miR-24-1 增強(qiáng)子基因座，發(fā)現(xiàn)miR-24-1的表達(dá)量下降，其鄰近基因不能再被激活，表明miR-24-1 鄰近基因的轉(zhuǎn)錄激活依賴于完整增強(qiáng)子的存在。此外，miR-24-1可激活增強(qiáng)子RNA（eRNA）表達(dá)，改變組蛋白修飾，增加增強(qiáng)子位點(diǎn)p300和RNA PolⅡ的富集，從而激活轉(zhuǎn)錄。Suzuki 等證明增強(qiáng)子可以通過(guò)募集Drosha和DGCR8 這2個(gè)在miRNA初始轉(zhuǎn)錄本（primary miRNA，pri-miRNA）剪接過(guò)程中發(fā)揮重要作用的蛋白，調(diào)控成熟的miRNA在細(xì)胞中的水平，進(jìn)而影響基因的表達(dá)[6]。目前，關(guān)于肺腺癌前饋環(huán)路的研究，多集中于miRNA-TF-基因所形成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，而增強(qiáng)子在該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮什么樣的作用、如何發(fā)揮作用，還不夠清晰。

考慮到前饋環(huán)路模型的多樣性和靈活性，我們?cè)诖藢⑵湟敕蜗侔┓肿訖C(jī)制的研究，通過(guò)數(shù)據(jù)篩選和處理，期望進(jìn)一步了解在肺癌腺產(chǎn)生過(guò)程中，增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄因子、miRNA、基因之間存在的調(diào)控關(guān)系。綜合多組學(xué)數(shù)據(jù)，本研究構(gòu)建了TF-增強(qiáng)子-miRNA的前饋環(huán)路，并探討該前饋環(huán)路的功能，為探究肺腺癌發(fā)生的分子機(jī)制及其調(diào)控機(jī)理提供新的思路，也為以網(wǎng)絡(luò)標(biāo)志物為主的肺腺癌診斷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 肺腺癌增強(qiáng)子數(shù)據(jù)的獲取

增強(qiáng)子數(shù)據(jù)下載自HACER[7]數(shù)據(jù)庫(kù)。該數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)GRO_seq和PRO_seq 整合FANTOM與其他轉(zhuǎn)錄非穩(wěn)定RNA的增強(qiáng)子，是目前最為全面的增強(qiáng)子數(shù)據(jù)庫(kù)。我們從HACER 數(shù)據(jù)庫(kù)下載肺腺癌A549細(xì)胞增強(qiáng)子3870個(gè)。

1.2 TF-增強(qiáng)子作用關(guān)系的識(shí)別

從Cistrome DB[8]和Unibind[9]數(shù)據(jù)庫(kù)下載獲取A549細(xì)胞系中的97個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的Chip-Seq 數(shù)據(jù)集（.bed 文件），作為轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合位點(diǎn)信息。當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)包含于同一染色體的增強(qiáng)子區(qū)域時(shí)，認(rèn)為該轉(zhuǎn)錄因子對(duì)該增強(qiáng)子具有調(diào)控關(guān)系。

1.3 增強(qiáng)子-miRNA作用關(guān)系的識(shí)別

miRNA位置信息下載自miRBase 數(shù)據(jù)庫(kù)[10]，miRNA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)數(shù)據(jù)下載自FANTOM 數(shù)據(jù)庫(kù)，人類蛋白質(zhì)編碼基因注釋數(shù)據(jù)下載自GEN?CODE 數(shù)據(jù)庫(kù)。根據(jù)先前的增強(qiáng)子調(diào)控miRNA研究[11]，對(duì)每個(gè)增強(qiáng)子的上游或下游，分別找到距增強(qiáng)子中心最近的miRNA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和同側(cè)的所有蛋白質(zhì)編碼基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。將增強(qiáng)子中心與miRNA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)間的距離定為M，增強(qiáng)子中心與同方向蛋白質(zhì)編碼基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)間的距離定為G。以調(diào)控評(píng)分公式計(jì)算score值，設(shè)定score值為0～0.2的增強(qiáng)子與miRNA之間存在調(diào)控關(guān)系。

1.4 TF-miRNA作用關(guān)系的識(shí)別

利用上述獲取的轉(zhuǎn)錄因子、miRNA數(shù)據(jù)，如轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)包含于miRNA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游10 kb 及下游1 kb，認(rèn)為該轉(zhuǎn)錄因子對(duì)該miRNA具有調(diào)控作用[12]。

1.5 TF-增強(qiáng)子-miRNA前饋環(huán)路的合并與多重假設(shè)檢驗(yàn)

將上述3 類調(diào)控關(guān)系進(jìn)行組合篩選，采用超幾何檢驗(yàn)獲取非隨機(jī)性的前饋環(huán)路。公式如下：

其中，M為miRNA總數(shù)，N為某一轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)控的miRNA總數(shù)，k為某一增強(qiáng)子所調(diào)控的miRNA總數(shù)，x為該轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)控的miRNA與該增強(qiáng)子所調(diào)控的miRNA的交集。依據(jù)Benjamini-Ho?chberge[13]方法，利用FDR值對(duì)該超幾何檢驗(yàn)的概率值進(jìn)行修正，并計(jì)算q值，將q≤0.05的前饋環(huán)路作為有生物學(xué)意義的前饋環(huán)路。

1.6 在前饋環(huán)路中提取關(guān)鍵性miRNA

miRNA都能夠?qū)虮磉_(dá)起調(diào)控作用，從構(gòu)建的TF-增強(qiáng)子-miRNA前饋環(huán)路中選擇參與多個(gè)前饋環(huán)路的miRNA，獲取參與前饋環(huán)路的每個(gè)miRNA的表達(dá)量，將miRNA高于平均miRNA表達(dá)的作為前饋環(huán)路關(guān)鍵性的miRNA。前饋環(huán)路關(guān)鍵性miRNA表達(dá)量下載自FANTOM5 數(shù)據(jù)庫(kù)[14]。

1.7 前饋環(huán)路關(guān)鍵性miRNA的靶基因識(shí)別與富集分析

從mirTarBase[15]數(shù)據(jù)庫(kù)下載經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)的miRNA靶基因，采用R軟件包c(diǎn)lusterProfiler 對(duì)miRNA靶基因進(jìn)行Gene Ontology（GO）與KEGG Pathway 功能富集分析。

1.8 前饋環(huán)路關(guān)鍵性miRNA的靶基因生存分析

利用KMplot[16]生存分析在線工具，選擇TF-增強(qiáng)子-miRNA前饋環(huán)路關(guān)鍵靶基因進(jìn)行臨床樣本的生存分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 轉(zhuǎn)錄因子、增強(qiáng)子、miRNA作用關(guān)系篩選

通過(guò)上述數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，獲取了97個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的DNA 結(jié)合位點(diǎn)信息、3870個(gè)肺腺癌組織特異性活性增強(qiáng)子區(qū)域信息、4801個(gè)miRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)信息和80 455個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)信息。最終，我們識(shí)別了227個(gè)TF-增強(qiáng)子作用關(guān)系，涉及61個(gè)轉(zhuǎn)錄因子和66個(gè)增強(qiáng)子；6973個(gè)增強(qiáng)子-miRNA作用關(guān)系，涉及3767個(gè) 增強(qiáng)子和1262個(gè)miRNA；10 715個(gè)TF-miRNA作用關(guān)系，涉及89個(gè)轉(zhuǎn)錄因子和1367個(gè)miRNA。

2.2 肺腺癌前饋環(huán)路構(gòu)建

通過(guò)對(duì)上述作用關(guān)系進(jìn)行整合，最終共獲得36個(gè)肺腺癌TF-增強(qiáng)子-miRNA前饋環(huán)路（表1），其中增強(qiáng)子（chr11：355877～356724）參與的前饋環(huán)路數(shù)目最多，為7個(gè)。本研究構(gòu)建的前饋環(huán)路涉及增強(qiáng)子，增強(qiáng)子對(duì)miRNA的調(diào)控全為正調(diào)控，由此構(gòu)建的前饋環(huán)路均為連貫前饋環(huán)路[3]。

在這些前饋環(huán)路中，平均每個(gè)miRNA涉及2.769個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，其中大于等于3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的miRNA有hsa-miR-6734、hsa-miR-4677、hsa-miR-6743、hsa-let-7i、hsa-miR-210、hsa-miR-4492、hsa-miR-6760。hsa-miR-210 已被證實(shí)與肺癌相關(guān)[17]。這些miRNA在肺癌發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中可能起關(guān)鍵作用，例如調(diào)控肺癌相關(guān)基因的表達(dá)，提高肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性、浸潤(rùn)性或異質(zhì)性等。

2.3 肺腺癌前饋環(huán)路關(guān)鍵miRNA的GO與KEGG功能富集分析

從mirTarBase 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取了36個(gè)TF-增強(qiáng)子-miRNA前饋環(huán)路中miRNA的所有靶基因，共計(jì)2404個(gè)，利用R 軟件包c(diǎn)lusterProfiler 對(duì)所有靶基因進(jìn)行了GO 功能富集。我們發(fā)現(xiàn)肺腺癌前饋環(huán)路在細(xì)胞周期正調(diào)控、細(xì)胞分化、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性調(diào)控、能量代謝和糖代謝等方面具有重要功能（圖1），這與文獻(xiàn)報(bào)道的癌細(xì)胞基因功能一致。通過(guò)功能富集分析，我們發(fā)現(xiàn)了在肺癌細(xì)胞中起關(guān)鍵作用的多效基因TP53、IGF1、TPR、CREB、CASP3、STAT5B、APP、USP19 等，其中TP53、IGF1、TPR、CREB、CASP3、STAT5B、APP、USP19 已被證實(shí)與腫瘤密切相關(guān)，如TP53[18]和CREB基因已被證實(shí)可顯著影響肺腺癌的增殖。Illiano 等采用脂聯(lián)素干預(yù)A549 肺腺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素可抑制CREB基因表達(dá)，顯著降低肺腺癌細(xì)胞的增殖[19]。

圖1 肺腺癌全前饋環(huán)路靶基因GO 功能富集結(jié)果

對(duì)靶基因進(jìn)行KEGG 通路富集分析（圖2），發(fā)現(xiàn)與肺腺癌前饋環(huán)路miRNA靶基因廣泛參與糖代謝、甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸代謝、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代謝、半胱氨酸/甲硫氨酸代謝等通路。該結(jié)果說(shuō)明肺腺癌前饋環(huán)路在大分子化合物代謝通路中起關(guān)鍵作用，該結(jié)果與癌細(xì)胞生理特征一致，其中涉及的關(guān)鍵基因有PGAM1、PGAM4、LDH4、LDHB、AGXT2 等。

為探究上述肺腺癌TF-增強(qiáng)子-miRNA前饋環(huán)路關(guān)鍵靶基因?qū)Ψ蜗侔┗颊叩挠绊懀覀儗?duì)其中參與富集功能（≥2個(gè)）的多效基因進(jìn)行生存分析。選擇具有表達(dá)活性差異的基因發(fā)現(xiàn)，TP53和CREB1在高表達(dá)時(shí)會(huì)使肺腺癌患者的生存率降低，而STAT5B和TPR在低表達(dá)時(shí)會(huì)使肺腺癌患者的生存率降低（圖3）。因此與多效基因TP53、CREB1、STAT5B、TPR 有關(guān)的前饋環(huán)路可能對(duì)肺腺癌的發(fā)展、轉(zhuǎn)移有重要影響。

2.4 肺腺癌前饋環(huán)路關(guān)鍵miRNA表達(dá)特征

依據(jù)FAMTOM5 提供的miRNA表達(dá)量數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)上述6個(gè)miRNA中，hsa-let-7i-3p、hsa-miR-210-5p、hsa-miR-6734-5p與hsa-miR-4677-5p在體內(nèi)的表達(dá)量顯著高于前饋環(huán)路涉及到的13個(gè)miRNA表達(dá)量的平均值，暗示這4個(gè)miRNA可能是肺腺癌的關(guān)鍵性miRNA。其中hsa-miR-6734參與了7個(gè)前饋環(huán)路，顯著高于表達(dá)量平均值2.769，共涉及7個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子ETS1、GABPA、PBX3、TEAD4、YY1、ZBTB33、DNase。其中的YY1已有文獻(xiàn)報(bào)道與腫瘤發(fā)生有關(guān)[20]。

表1 36個(gè)肺腺癌TF-增強(qiáng)子-miRNA前饋環(huán)路

圖2 肺腺癌全前饋環(huán)路靶基因KEGG 通路富集結(jié)果

2.5 4個(gè)關(guān)鍵miRNA靶基因功能分析

圖3 多效基因TP53（A）、CREB1（B）、

分別對(duì)上述4個(gè)關(guān)鍵miRNA靶基因進(jìn)行GO功能分析和KEGG 通路分析。一方面我們獲取了這4個(gè)關(guān)鍵miRNA的功 能活性，hsa-miR-6734 具有強(qiáng)的核酸轉(zhuǎn)錄抑制活性，hsa-miR-210 具有強(qiáng)的分解代謝活性，hsa-let-7i 具有強(qiáng)的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，而hsa-miR-4677 無(wú)明確的富集功能。另一方面，構(gòu)建4個(gè)關(guān)鍵miRNA的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-210 調(diào)控細(xì)胞分解代謝和應(yīng)激反應(yīng)功能的關(guān)鍵靶基因PLK1、APC、BNIP3、ATG7、SIN3A，hsa-miR-6734 調(diào) 控 各 類 復(fù) 合 物（NuRD、CHD 類等）功能的關(guān)鍵靶基因MTA1、CSNK2A1、RBBP4、ZBTB7A，hsa-let-7i細(xì)胞周期正調(diào)節(jié)功能的關(guān)鍵靶基因IGF1、PDGFB、CDKN1A、CCND1、EDN1和CCNT2。

2.6 結(jié)論

我們探討了TF-增強(qiáng)子、增強(qiáng)子-miRNA、TFmiRNA作用關(guān)系，并識(shí)別了肺腺癌細(xì)胞系相關(guān)的36 條TF-增強(qiáng)子-miRNA前饋環(huán)路，涉及22個(gè)轉(zhuǎn)錄因子、13個(gè)增強(qiáng)子、13個(gè)miRNA。在功能富集和通路富集方面，我們發(fā)現(xiàn)肺腺癌細(xì)胞TF-增強(qiáng)子-miRNA前饋環(huán)路靶基因顯著富集于與癌癥密切相關(guān)的生物功能上，如細(xì)胞周期正調(diào)控、細(xì)胞分化、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性調(diào)控、能量代謝和糖代謝等，其中涉及的關(guān)鍵基因已被很多研究證實(shí)在癌癥細(xì)胞中特異表達(dá)。KEGG 通路富集結(jié)果顯示前饋環(huán)路靶基因富集于肺癌代謝相關(guān)信號(hào)通路。結(jié)合miRNA的參與環(huán)路數(shù)和表達(dá)量，我們篩選了前饋環(huán)路關(guān)鍵miRNAhsa-miR-6734、hsa-miR-210、hsa-miR-4677和hsa-let-7i，探討了它們與基因的調(diào)控關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。另外，我們對(duì)參與富集功能多的多效基因進(jìn)行肺腺癌生存分析，發(fā)現(xiàn)前饋環(huán)路的多效靶基因TP53、CREB1、STAT5B、TPR的表達(dá)差異對(duì)患者肺癌的生存發(fā)展有重要影響。本研究揭示了肺腺癌相關(guān)前饋環(huán)路的特點(diǎn)，為以后肺腺癌前饋環(huán)路研究提供理論與方法參考。