李素芬，王唯斯，楊娜，梅雯，孫美濤，熊偉

1.大理大學 基礎醫(yī)學院，云南 大理671000；2.楚雄州人民醫(yī)院病理科，云南 楚雄675000；3.杭州醫(yī)學院 基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院，浙江 杭州310000

人類線粒體基因組的轉錄機制一直是現(xiàn)代醫(yī)學的前沿問題。人類線粒體DNA（mitochondri?al DNA，mtDNA）的轉錄過程分為起始、延伸和終止3個階段，需要許多順式作用元件和反式作用因子的共同參與[1]。目前，已經(jīng)基本確認了哺乳動物mtDNA 轉錄裝置的重要組成部分，主要包括線粒體轉錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）、線粒體轉錄因子B2（mitochondrial transcrip?tion factor B2，TFB2M）、線粒體RNA 聚合酶（mito?chondrial RNA polymerase，mtRNAP）、線粒體轉錄延伸因子（mitochondrial transcription elongation fac?tor，TEFM）及線粒體轉錄終止因子（mitochondrial transcription termination factors，MTERFs）[2]。在mtDNA 轉錄過程中，除了必要的轉錄裝置成分調控轉錄外，一些核轉錄調節(jié)因子也可以通過結合mtDNA 來調控轉錄。本文總結了mtDNA 轉錄的基本過程和轉錄因子在mtDNA 轉錄起始、延伸和終止過程中的作用，以及調控轉錄的其他因素。

1 mtDNA的結構

mtDNA 是一個環(huán)狀的DNA，其長度約為16.5 kb，共編碼37個基因（圖1A）[3]，其中D-loop 區(qū)為非編碼區(qū)。重鏈（heavy strand，H）和輕鏈（light strand，L）是根據(jù)2 條鏈的G+T 含量不同和變性氯化銫密度梯度而劃分的，H 鏈編碼2種rRNA、14種tRNA和12種蛋白質（ND6 除外），L 鏈編碼8種tRNA和ND6 蛋白（圖1B）[4-5]。人mtDNA的轉錄由2個啟動子指導，即輕鏈啟動子（light strand pro?moter，LSP）和重鏈啟動子（heavy strand promoter，HSP），分別位于相對的mtDNA 鏈中。

2 mtDNA的轉錄起始

線粒體轉錄起始過程是由mtRNAP、TFAM和TFB2M 共同參與進行的。其中mtRNAP 是研究最廣泛的線粒體轉錄相關酶，包含1230個氨基酸殘基，是線粒體RNA 轉錄裝置的核心。人類細胞中的mtRNAP只有在輔助因子TFAM和TFB2M的參與下，才能與啟動子作用啟動轉錄。TFAM 由2個HMG box 結構域和1個C端尾結構組成，有顯著的誘導線粒體DNA 形成U 形轉彎的能力，對線粒體與其他轉錄因子的相互作用至關重要。TFB2M是一個促進mtRNAP 啟動線粒體RNA 轉錄的關鍵因子，其活性遠遠高于TFB1M[6]。

圖1 mtDNA的結構及其轉錄產(chǎn)物

TFAM 作為轉錄起始階段的關鍵因子，能夠被mtRNAP 有效識別，通過與轉錄起始位點上游的特異性結合激活轉錄，TFB2M 增強了mtRNAP識別轉錄起始點的能力[7]。TFAM、TFB2M和mtRNAP 三者之間相互作用，TFAM與輕鏈轉錄起始點上游彎曲的DNA 結合，其C端激活區(qū)與TFB2M 結合，TFB2M 把TFAM和位于啟動子處的mtRNAP 連 接在一起[8]。由 于TFAM和mtRNAP 形成的起始復合物不能在沒有TFB2M的情況下轉錄，TFB2M 作為TFAM和mtRNAP的紐帶，可以促進DNA 雙鏈開放，結合啟動子，以及誘導mtRNAP的構象變化，穩(wěn)定啟動子復合物，從而提高轉錄起始效率[1]。

3 mtDNA的轉錄延伸

轉錄起始激活后，TEFM 參與轉錄延伸過程，在體內(nèi)和體外提高線粒體基因轉錄延伸的效率和轉錄活性[2,9]。已有研究表明，保守序列塊Ⅱ（conserved sequence blockⅡ，CSBⅡ）是存在于人mtDNA 中的非常重要的轉錄調節(jié)序列，含有富含G的基序序列，在轉錄終止過程中起關鍵作用[3]。當mtRNAP 通過CSBⅡ轉錄時，可以與TEFM 結合形成一種發(fā)夾結構G-四鏈體（G-quadruplex），從而觸發(fā)轉錄終止。TEFM 是調控mtDNA 復制和轉錄轉換的關鍵分子開關。當無TEFM 時，G-四鏈體的形成使mtRNAP 可在輕鏈原點附近停止，產(chǎn)生小的RNA片段，作為復制引物，這時mtDNA 開始復制；當有TEFM 時，阻止發(fā)夾結構G-四鏈體的形成，mtRNA 通過CSBⅡ繼續(xù)轉錄。

在mtRNAP 介導的轉錄延伸過程中，mtRNAP和模板DNA 及轉錄產(chǎn)物RNA 緊密結合，形成一個非常穩(wěn)定的延伸三維復合物（elongation complex，EC）[10]。研究發(fā)現(xiàn)，在沒有TEFM的情況下，EC 不穩(wěn)定，解離與合成非常迅速，但效率低下；TEFM存在時，EC 會繼續(xù)延長。進一步的研究表明，TEFM 能夠決定mtRNAP 產(chǎn)生長的轉錄本[2]。通過RNA 干擾敲低TEFM后，H 鏈和L 鏈啟動子遠端線粒體轉錄物的水平降低，并伴隨著哺乳動物細胞的氧化呼吸鏈缺陷[5]。Jiang 等在小鼠中敲除TEFM，證實了TEFM 對線粒體轉錄延伸和RNA 加工的過程至關重要[11]。

4 mtDNA的轉錄終止

MTERF 由核基因編碼，以單體形式彎曲DNA從而與mtDNA 特異性結合。人MTERF1 是在人線粒體中發(fā)現(xiàn)的MTERF 家族第一個轉錄因子，在線粒體轉錄中起終止作用。在體外，磷酸化的MTERF1 結合特異的mtDNA 能達到最大的轉錄終止活性，且不需要其他蛋白因子協(xié)助終止[12]。

目前已基本明確，轉錄終止區(qū)域（transcrip?tion termination region，TERM）為16S rRNA基因與tRNALeu（UUR）基因分界處一段28bp的序列，MTERF1與該區(qū)域特異性結合，引起HSP1 啟動的轉錄終止。已有研究證明，MTERF1在體外還可以高效終止HSP2 啟動的轉錄，以促進rRNAs的合成[13]。MTERF1 控制了從HSP2 到16S rRNA的轉錄，產(chǎn)生mtDNA 轉錄環(huán)，有助于促進轉錄因子循環(huán)利用和轉錄反復進行，提高轉錄速度，使上游rRNA基因的轉錄水平較下游基因高15～60倍，同時也更容易重新起始轉錄[13]。MTERF1 特異性識別鳥嘌呤殘基進行轉錄終止，當機體發(fā)生線粒體肌病腦病伴乳酸中毒血癥及卒中樣發(fā)作綜合征（mitochondrial encephalomyopathy，lactic acidosis，and stroke-like episodes，MELAS）等線粒體疾病時，這種作用會被阻遏[14]。研究發(fā)現(xiàn)，MTERF1 中間的結合位點A3243G 突變可以減低MTERF1與DNA的親和力，從而達到降低轉錄終止的作用。然而，小鼠體內(nèi)基因敲除實驗表明，MTERF1 能結合雙向終止位點，可以完全終止輕鏈的轉錄，但重鏈的轉錄終止可能還需要MTERF1 以外的蛋白質參與，其具體發(fā)生機制目前尚未清楚[6]。

5 mtDNA的轉錄調控

除了mtDNA 轉錄機制裝置中的核心元件外，細胞核中的某些因子也被導入線粒體與mtDNA結合并直接調控其轉錄[15-16]。早期研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺激素可以與D-loop 區(qū)和12S rRNA基因結合，并在線粒體定位[17]。此外，研究證實，線粒體cAMP反應元件結合蛋白（cAMP response ele?ment binding protein，CREB）與線粒體D-loop 區(qū)的DNA 結合，促進mtDNA基因表達[18-20]。與線粒體D-loop 區(qū)結合調控轉錄的還有細胞信號轉導與轉錄激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）[21]、組蛋白乙酰轉移酶MOF[22]、活化T細胞核因子1（nuclear factor of ac?tivated T-cells，cytoplasmic 1，NFATc1）[23]、DNA 甲基轉移酶（DNA methyltransferase 1，Dnmt1）[24]，其中Dnmt1 可以降低mtDNA 轉錄水平。后來研究證明肌細胞增強因子2D（myocyte enhancer fac?tor 2D，MEF2D）可以與線粒體ND6 結合并在體內(nèi)調控轉錄[25]。最近，多重染色質免疫沉淀實驗與深度測序聯(lián)合，揭示了c-Jun、JunD和CEBP-β在體內(nèi)與mtDNA 結合及其在體內(nèi)的線粒體定位[26]，其中c-Jun和CEBP-β與線粒體的ND4 結合，c-Jun 還和JunD與線粒體的ND3 結合。除了通過直接結合mtDNA 調節(jié)轉錄，核轉錄調節(jié)因子可以通過調節(jié)線粒體轉錄因子來調控轉錄。研究發(fā)現(xiàn)，核呼吸因子（nuclear respiratory factor，NRF）NRF1和NRF2 可以控制TFB2M和mtRNAP 從而調控轉錄[27-28]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因 子1（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1，PGC1）家族的PGC1α、PGC1β和PRC 依次調節(jié)NRF1[29-30]、NRF2[31-32]和轉錄阻遏蛋白Ying-Yang 1（YY1）[33]，從而影響線粒體基因表達。其中PGC1α可以通過在mtDNA D-loop 區(qū)與TFAM 形成復合體來增加線粒體基因在高能量需求期間的表達[34]。此外，線粒體核糖體蛋白L12（mitochondrial ribosomal protein L12，MRPL12）通過控制mtRNAP 穩(wěn)定性調節(jié)線粒體轉錄過程[35]，其表達與線粒體轉錄物的穩(wěn)態(tài)水平相關[36-37]。有研究證明，線粒體轉錄也受線粒體ATP 濃度變化的影響，高濃度的ATP 抑制體外mtRNAP的活性，正常濃度的ATP 激活轉錄，極低濃度的ATP 阻止轉錄起始[38]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)mtDNA 甲基化可以導致TFAM的翻譯后修飾、線粒體類核縮小、限制mtRNAP和TFB2M的作用[39]。已有研究并沒有全面描述線粒體轉錄的調控機制，因此，需要對線粒體轉錄調控機制進行更加深入地探索。人類mtDNA 調控元件的結合位點參見文獻[40]。

6 結語

隨著對哺乳動物線粒體功能研究的日益重視，獲得了很多線粒體轉錄因子的結構信息和調控線粒體轉錄的機制。這些研究使人們對線粒體轉錄過程及其機制有了更深入的認識，但仍然有很多調節(jié)機制和某些調控的細節(jié)并不十分清楚，有待進一步探索。目前，新一代測序技術取得了最新進展，為深入研究線粒體DNA 生物學提供了便利，從而加深對轉錄機制的認識，并有可能為未來的線粒體基因靶向治療等提供基礎研究數(shù)據(jù)。