韋娜，付楚溪，汪建華，熊向華，張惟材

軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京100071

肉毒毒素（botulinum neurotoxins，BoNTs）是一類由肉毒梭菌產(chǎn)生的神經(jīng)毒素，為已知毒性最強的細(xì)菌毒素，通過阻礙神經(jīng)-肌肉突觸傳遞引起松弛性麻痹發(fā)揮毒性作用。BoNTs 包括A～G 共7種血清型，其中BoNT/A、BoNT/B、BoNT/E和BoNT/F 能夠引起人類肉毒中毒[1-2]。BoNTs的合成包括以下步驟：首先，肉毒梭菌合成相對分子質(zhì)量（Mr）為150 000的單鏈前體蛋白，隨后在細(xì)菌自身內(nèi)源蛋白酶的作用下，毒素前體被切割為Mr為100 000的重鏈（HC）和50 000的輕鏈（LC），二者通過一對鏈間二硫鍵連接[3]。

已有BoNT/A在大腸桿菌中表達(dá)的研究，但其表達(dá)方式及載體構(gòu)建細(xì)節(jié)均無明確報道[4-6]。我們曾嘗試用pET22b（+）載體在大腸桿菌中好氧表達(dá)BoNT/A的HC 但未成功。本實驗中我們探索了厭氧表達(dá)HC的方法，并且與普通好氧表達(dá)條件比較，發(fā)現(xiàn)厭氧條件表達(dá)的HC 活性較強。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）感受態(tài)，PCR 產(chǎn)物純化試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒，蛋白定量試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；表達(dá)載體pTIG-TrxA 及一抗C25（本所孫志偉研究員惠贈）；DNA 序列、寡聚核苷酸引物（北京奧科生物技術(shù)公司合成）；限制性內(nèi)切酶、DNA 聚合酶、DNA 連接酶（TaRaKa 公司）；二抗羊抗人IgG（北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司）；其他試劑耗材（軍事醫(yī)學(xué)研究院條件處）。

1.2 HN編碼序列的設(shè)計合成

參照GenBank 公布的BoNT/A-HC基因序列，按大腸桿菌偏好密碼子對重鏈N端（HN）編碼序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化。

1.3 HC表達(dá)載體的構(gòu)建

以攜帶合成的HN編碼序列的載體及pTIGTrxA-HC為模板、HF-E/R 及F/HR-X 為引物（表1），分別PCR 擴(kuò)增HN與重鏈C端（HC）編碼序列（PCR 擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，40℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，30 次循環(huán)；72℃終延伸10 min）。PCR 產(chǎn)物1∶1 混合為模板、HF-E/HR-X 為引物，重疊延伸PCR 連接HN與HC編碼序列（PCR 擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，40℃退火30 s，72℃延伸3 min，30 次循環(huán)；72℃終延伸10 min）。PCR 產(chǎn)物與載體pTIG-TrxA 經(jīng)EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切，回收連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。

表1 引物及序列

1.4 HC表達(dá)條件的考察

主要考察不同菌落、培養(yǎng)方式（搖床培養(yǎng)、靜置培養(yǎng)）、培養(yǎng)基體積（5、10、15 mL LB）、抗氧化劑硫代乙醇酸鈉（STGC）濃度（0%、0.05%、0.1%、0.2%）等因素對HC表達(dá)的影響，實驗采取多因素多水平正交設(shè)計。

1.5 ELISA

抗原包被96 孔板，4℃過夜，洗板3 次；加200 μL 含5%脫脂奶粉的PBST，37℃封閉2 h，洗板3 次；加100 μL 一抗C25，37℃孵育2 h，洗板3次；加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG，37℃孵育2 h，洗 板5 次，OPD 顯 色。OPD 顯 色 條 件：5.14 mL 0.2 mol/L Na2HPO4與4.86 mL 0.1 mol/L檸檬酸混合，加入50 μL 30%的H2O2，混勻，加入4 mg OPD，混勻，每孔100 μL，室溫作用5 min，加50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。

1.6 蛋白表達(dá)定量

以不同濃度BoNT/A-HC與C25[7-8]的結(jié)合做標(biāo)準(zhǔn)曲線，ELISA檢測HC與C25的結(jié)合，測定D490nm值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算HC表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 HN編碼序列的設(shè)計

根據(jù)密碼子簡并性，按大腸桿菌偏好密碼子設(shè)計HN編碼序列，優(yōu)化后序列與原序列相似度為79.70%。

2.2 HC表達(dá)載體構(gòu)建

以攜帶合成的HN編碼序列的載體及pTIGTrxA-HC為模板、HF-E/RF/HR-X 為引物PCR 擴(kuò)增HN與HC編碼序列，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。重疊延伸PCR 連接HN與HC編碼序列，獲得約2500 bp的片段，切下目的條帶用PCR 產(chǎn)物純化試劑盒回收，與載體pTIG-TrxA 經(jīng)EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切，回收載體與HC基因，16℃連接過夜，次日轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取克隆，提質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定（圖1），將陽性克隆測序，測序結(jié)果與設(shè)計序列完全一致。

2.3 HC表達(dá)條件的考察

2.3.1 HC 好氧表達(dá) 將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），涂LB/Amp 平皿，挑取菌落，37℃、200 r/min 搖床培養(yǎng)至D600nm約0.5，30℃、0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)，樣品進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果顯示Mr約100 000 處有特異條帶（圖2）。切下特異條帶進(jìn)行膠內(nèi)酶切肽譜鑒定（圖3），結(jié)果顯示所表達(dá)的特異帶為BoNT/A-HC。

對誘導(dǎo)劑IPTG 濃度（0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.1、0.2、0.5 mmol/L）、誘導(dǎo)時間（6、8、12 h）、誘導(dǎo)溫度（20℃、30℃）進(jìn)行正交設(shè)計，考察目的蛋白的表達(dá)，SDS-PAGE檢測。結(jié)果見圖4，0.5 mmol/L IPTG、30℃誘導(dǎo)6 h 時目的蛋白表達(dá)量相對較大，但目的蛋白幾乎不與C25 抗體結(jié)合，

圖1 質(zhì)粒pTIG-TrxA-HC的EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳

圖2 SDS-PAGE檢測HC的好氧表達(dá)與厭氧表達(dá)

圖3 HC膠內(nèi)酶切肽譜鑒定

2.3.2 HC 好氧表達(dá)與厭氧表達(dá)比較 將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），涂LB/Amp平皿，挑取菌落分別搖床培養(yǎng)和靜置培養(yǎng)，30℃、0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)，樣品進(jìn)行SDS-PAGE和與C25的ELISA 檢 測。SDS-PAGE 結(jié) 果 顯 示 厭 氧 培養(yǎng)時HC 條帶大小約100KD，搖床培養(yǎng)表達(dá)的HC條帶Mr略低于100 000（圖2）；ELISA 結(jié)果顯示，厭氧培養(yǎng)時表達(dá)的HC與C25的結(jié)合活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于搖床培養(yǎng)，搖床培養(yǎng)時表達(dá)的HC與C25 結(jié)合活性極不穩(wěn)定，有時能檢測到微弱結(jié)合，有時幾乎檢測不到結(jié)合（圖5）。

取72 支試管，等分為3 組，探討培養(yǎng)方式、培養(yǎng)基體積、抗氧化劑濃度等因素對HC表達(dá)的影響。收集菌體，超聲裂解，包被96 孔板，ELISA檢測菌體裂解液與C25的結(jié)合，測定D490nm值，結(jié)果見表2；培養(yǎng)基體積為5～15 mL 時，3個菌落的目的蛋白表達(dá)量與培養(yǎng)基體積基本呈S 型曲線關(guān)系（圖6），而抗氧化劑濃度對HC表達(dá)的影響不明顯。

2.3.3 HC表達(dá)定量 將BoNT/A-HCC梯度稀釋，ELISA檢測與C25的結(jié)合，以lg（BoNT/A-HCC）為橫坐標(biāo)、D490nm為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖7），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得HC表達(dá)水平為64.7 μg/mL。

圖4 ELISA檢測好氧表達(dá)的HC與HCC抗血清及C25的結(jié)合

圖5 不同單菌落好氧或厭氧表達(dá)HC與C25 結(jié)合的ELISA檢測

3 討論

我們最初嘗試用pTIG-TrxA 好氧表達(dá)HC，得到了相對分子質(zhì)量疑似正確的HC（圖2），ELISA結(jié)果顯示HC 可以與HC 抗血清結(jié)合，并且肽譜鑒定比對結(jié)果也顯示所比對的序列的確屬于HC，但動物實驗結(jié)果表明該HC 活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于陽性對照組，由此我們懷疑所表達(dá)的HC 并不完整，可能只是HC的一部分。我們推測是因為表達(dá)的HC對宿主菌有毒性，激發(fā)宿主菌的保護(hù)機(jī)制，從而導(dǎo)致表達(dá)不完整的對宿主菌無毒性的蛋白或完整的HC 被降解，具體原因有待進(jìn)一步考察。為了解決這個問題，我們嘗試了厭氧表達(dá)。SDSPAGE 顯示厭氧表達(dá)條帶的相對分子質(zhì)量比好氧表達(dá)條帶稍大，而厭氧表達(dá)條帶與C25的結(jié)合活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于好氧表達(dá)，動物實驗結(jié)果也顯示厭氧表達(dá)的HC 活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于好氧表達(dá)。這一方面說明厭氧條件更加適合HC的表達(dá)，另一方面也說明可以通過與C25的結(jié)合檢測HC 活性，但不能通過與HC 抗血清的結(jié)合檢測HC 活性，這可能是因為抗血清中有針對HC 多個表位的抗體的緣故。

對HC 厭氧表達(dá)條件的考察結(jié)果顯示，3個因素對HC表達(dá)量影響大小依次是培養(yǎng)方式＞培養(yǎng)基體積＞硫代乙醇酸鈉濃度。在厭氧表達(dá)時，硫代乙醇酸鈉的濃度幾乎看不出來影響，但在好氧表達(dá)時可見（尤其是2 號菌落更加明顯）在實驗濃度范圍內(nèi)，硫代乙醇酸鈉濃度越高，HC表達(dá)量越高，這也進(jìn)一步說明了厭氧條件對HC表達(dá)的重要性。

雖然表達(dá)的HC 已經(jīng)達(dá)到較高水平，但厭氧培養(yǎng)菌體生長速率很低和菌濃有限成為HC 大量制備的瓶頸，高效表達(dá)HC的方法依然有待進(jìn)一步探索。我們考慮從如下幾方面考察HC 厭氧表達(dá)與好氧表達(dá)效率差別如此之大的機(jī)制，以從根本上解決HC 發(fā)酵的難題。首先，厭氧條件和好氧條件所導(dǎo)致二者最直觀的區(qū)別表現(xiàn)在生長速率上，在一定范圍內(nèi)，厭氧條件越嚴(yán)格，菌體生長越緩慢，所以我們需要證實是否菌體生長速率影響了HC的表達(dá)。其次，就是上文所述的HC 好氧表達(dá)降解的問題，我們希望能夠通過蛋白測序或精確分子量質(zhì)譜獲得好氧條件下表達(dá)的低活性HC的信息，這樣或許能夠通過對HC的改造解決難題。另外，更深入地比較厭氧與好氧條件下大腸桿菌及HC 相關(guān)機(jī)制（如呼吸鏈[9]、轉(zhuǎn)錄組學(xué)[10]）也顯得很有必要，一方面有望通過這一途徑解決HC 發(fā)酵的問題，另一方面也可以更進(jìn)一步研究大腸桿菌的生物學(xué)特性，為其他蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)提供新的思路。

表2 不同試驗條件下HC與C25的結(jié)合（D490nm）

圖6 不同菌落不同STGC 濃度時HC 厭氧表達(dá)情況

圖7 ELISA 定量有活性的HC表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)曲線