李曉強(qiáng)，隋峰，王洋，趙麗鳳，李慧杰，譚余慶

中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京100029

惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的重大致死疾病，隨著人類居住環(huán)境的惡化，惡性腫瘤的種類越來(lái)越多，隨之產(chǎn)生的腫瘤耐藥性等問(wèn)題也越來(lái)越受到研究者的重視。Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路是機(jī)體在抵抗外來(lái)應(yīng)激時(shí)最重要的內(nèi)源性氧化應(yīng)激通路，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的Ⅱ相代謝酶和抗氧化酶等蛋白在保護(hù)正常細(xì)胞中發(fā)揮重要作用[1]。但與此同時(shí)，Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路對(duì)某些腫瘤細(xì)胞也表現(xiàn)出促進(jìn)作用，而對(duì)另外某些腫瘤細(xì)胞卻表現(xiàn)出抑制作用，這種雙重作用使得以Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路為作用靶點(diǎn)的藥物研發(fā)必須得到足夠的重視。我們就Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的雙重作用及其在腫瘤耐藥性中的影響做簡(jiǎn)要綜述，為以此信號(hào)通路為作用靶點(diǎn)的藥物研發(fā)提供新思路。

1 Nrf2、Keapl、ARE的基本結(jié)構(gòu)

1.1 Nrf2的結(jié)構(gòu)

核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor E2 re?lated factor 2，Nrf2）屬于Cap-n-Collar（CNC）蛋白家族，該家族成員均具有高度保守的堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper，bZip）結(jié)構(gòu)[2]。基于其保守序列，Nrf2 分為7個(gè)結(jié)構(gòu)功能域（圖1），即Neh1～Neh7（Nrf2-ECH homology）[3-4]。Neh1 結(jié) 構(gòu)域包含bZIP 結(jié)構(gòu)，其與細(xì)胞核內(nèi)小Maf 蛋白形成異源二聚體，使Nrf2 能夠識(shí)別并結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE），繼而啟動(dòng)下游相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄[5]。Neh2 結(jié)構(gòu)域含有2個(gè)重要保守區(qū)域DLG和ETGE，是Nrf2與Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein-1，Keap1）結(jié)合的區(qū)域，正是基于這2個(gè)區(qū)域與Keap1的相互作用，才使得Nrf2 能夠穩(wěn)定存在于細(xì)胞質(zhì)[6]。位于C端的Neh3 結(jié)構(gòu)域?qū)rf2的轉(zhuǎn)錄活性非常重要，該蛋白最后16個(gè)氨基酸殘基的缺失會(huì)完全破壞其激活報(bào)告基因和內(nèi)源性基因表達(dá)的能力[7]。Neh4和Neh5 結(jié)構(gòu)域是Nrf2的2個(gè)獨(dú)立激活區(qū)，它們分別與cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）結(jié)合，并與之協(xié)同作用起到活化轉(zhuǎn)錄的作 用[8]。Neh6 包 含2個(gè) 模 序，即DSGIS和DSAPGS，是一段非依賴于Keap1 調(diào)控Nrf2 降解的結(jié)構(gòu)域[9]。Neh7 是新發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)域，可特異性地與維甲酸X 受體α（retinoid X receptor α，RXRα）作用從而抑制Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路[3]。

1.2 Keap1的結(jié)構(gòu)

Keap1 是Cullin3與泛素連接酶E3 復(fù)合物的底物結(jié)合蛋白，該復(fù)合物可識(shí)別Nrf2，也可作為細(xì)胞外源性物質(zhì)和氧化應(yīng)激的傳感器[10]。Keap1屬于Kelch 家族多區(qū)域阻遏蛋白，包含5個(gè)主要的功能結(jié)構(gòu)域（圖1），分別為N端結(jié)構(gòu)域（N-termi?nal region，NTR）、干 預(yù) 區(qū)（intervening region，IVR）、BTB（broad complex, tramtrack and Bric-a-Brac）區(qū)、雙甘氨酸重復(fù)區(qū)（double glycine repeats，DGR）和C端結(jié)構(gòu)域（C-terminal region，CTR）。其中DGR 區(qū) 也叫Kelch 區(qū)，是Keap1與Nrf2的Neh2部位結(jié)合區(qū)[11]。

圖1 Nrf2和Keap1 結(jié)構(gòu)示意圖

1.3 ARE的結(jié)構(gòu)

ARE 是一種順式作用元件，核心序列為5'-（G/A）TGA（G/C）nnnGC（G/A）-3'。研究證實(shí)，Bach1和Nrf2 互相競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合ARE，從而調(diào)節(jié)ARE介導(dǎo)的基因表達(dá)[12]。

2 Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制

在正常生理狀態(tài)下，Nrf2 通過(guò)其Neh2 結(jié)構(gòu)域與負(fù)調(diào)控蛋白Keap1的Kelch 區(qū)相互作用，穩(wěn)定存在于細(xì)胞質(zhì)中，Nrf2 經(jīng)泛素蛋白酶體途徑被降解，因此Nrf2的表達(dá)水平得以維持在較低的水平，機(jī)體處于一個(gè)氧化-抗氧化平衡的狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到活性氧（ROS）或其他親核劑刺激后，Nrf2與Keap1 解偶聯(lián)，活化的Nrf2 轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核，與小Maf 蛋白結(jié)合成異質(zhì)二聚體后與ARE 結(jié)合，激活靶基因表達(dá)，調(diào)控Ⅱ相代謝酶和抗氧化酶等蛋白的轉(zhuǎn)錄活性（圖2）[13]，從而發(fā)揮抗氧化損傷作用，使細(xì)胞恢復(fù)氧化-抗氧化平衡狀態(tài)。

Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路的激活主要取決于Nrf2的激活，而Nrf2的激活主要由Keap1 介導(dǎo)及Nrf2 自身的磷酸化等調(diào)控。目前，由Keap1 介導(dǎo)的Nrf2 激活機(jī)制有一種比較流行的學(xué)說(shuō)，即所謂的“鉸鏈和門閂”機(jī)制[14-15]。該機(jī)制認(rèn)為以二聚體形式存在的Keap1的2個(gè)DGR 區(qū)通過(guò)與Nrf2的DLG和ETGE 結(jié)構(gòu)域錨定在一起。親和力相對(duì)高的ETGE 區(qū)和親和力相對(duì)弱的DLG 區(qū)分別扮演著“鉸鏈”和“門閂”的角色。氧化應(yīng)激等刺激使得Nrf2的DLG 區(qū)與Keap1的DGR 區(qū)解 離，而Nrf2的ETGE 區(qū)仍然與Keap1的DGR 區(qū)穩(wěn)定結(jié)合在一起，使得Keap1-Nrf2 復(fù)合物穩(wěn)定存在于細(xì)胞質(zhì)；而同時(shí)新生成的Nrf2的ETGE 區(qū)由于無(wú)法和Keap1 結(jié)合，從而在細(xì)胞質(zhì)中累積并陸續(xù)轉(zhuǎn)入核內(nèi)與Maf蛋白結(jié)合成二聚體，進(jìn)而結(jié)合ARE 促進(jìn)下游相關(guān)靶基因的表達(dá)。

另外，還有一些學(xué)者認(rèn)為一些蛋白激酶使Nrf2 發(fā)生磷酸化，致使其構(gòu)象發(fā)生改變，從而促使Nrf2與Keap1 發(fā)生解離。例如，蛋白激酶C（PKC）可使Nrf2的Ser40 位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，從而改變Nrf2的構(gòu)象，避免E3 泛素化連接酶對(duì)Nrf2的識(shí)別而阻礙降解，增加其在細(xì)胞質(zhì)中的含量并且增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性[16]。

3 Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路在腫瘤發(fā)展中的雙重作用

3.1 Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路對(duì)腫瘤的抑制作用

正常狀態(tài)下，細(xì)胞質(zhì)中的Nrf2與Keap1 結(jié)合并處于活性相對(duì)抑制狀態(tài)。當(dāng)用一些外源物質(zhì)處理正常細(xì)胞時(shí)，引起Nrf2與Keap1 解偶聯(lián)，激活此信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并啟動(dòng)靶基因如醌氧化還原酶1（NQO1）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、血紅素氧合酶1（HO-l）等的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，提高了細(xì)胞的氧化應(yīng)激及修復(fù)功能，避免了腫瘤的發(fā)生[17]。

圖2 Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路

Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路能防止正常細(xì)胞發(fā)生癌變，使某些腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。Wang 等合成了一種新的化合物PBQC，發(fā)現(xiàn)其高濃度條件下可通過(guò)增強(qiáng)Nrf2 活性從而抑制HeLa、A549、U87和HUVECs 等腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，而不抑制正常的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)。此外，PBQC 可以引起Keap-1蛋白s-谷胱甘肽酰化，促進(jìn)Nrf2 核易位和促凋亡基因的表達(dá)，從而使癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[18]。

這些研究結(jié)果表明Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路對(duì)某些腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，其機(jī)制主要是通過(guò)增強(qiáng)Nrf2的活性，促進(jìn)其核異位來(lái)誘導(dǎo)相關(guān)保護(hù)蛋白抵抗正常細(xì)胞發(fā)生惡變的能力，同時(shí)提高腫瘤細(xì)胞中某些促凋亡蛋白的表達(dá)進(jìn)而促使其發(fā)生凋亡。

3.2 Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路對(duì)腫瘤的促進(jìn)作用

臨床研究統(tǒng)計(jì)分析表明，Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Nrf2的異常高表達(dá)會(huì)促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌、喉癌、肝癌細(xì)胞SMMC-7721 等的發(fā)展[19-21]。

CDK20 是一種新發(fā)現(xiàn)的蛋白激酶，在多種癌癥的細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖中發(fā)揮重要作用，研究證明CDK20 通過(guò)自身保守的ETGE 結(jié)構(gòu)域與Nrf2 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Keap1，從而增強(qiáng)Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性，降低細(xì)胞內(nèi)ROS 水平，增強(qiáng)肺癌細(xì)胞的放化療耐藥性[22]。這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路能促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展，其機(jī)制主要通過(guò)增強(qiáng)Nrf2的活性，進(jìn)而增強(qiáng)下游抗氧化蛋白的表達(dá)，加強(qiáng)細(xì)胞抵抗外來(lái)應(yīng)激及其耐藥性的能力。

4 Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路介導(dǎo)的腫瘤耐藥性

腫瘤耐藥性（multidrug resistance，MDR）是影響腫瘤化療效果的絆腳石。MDR的形成機(jī)制非常復(fù)雜，目前大多數(shù)研究表明這些機(jī)制主要包括多藥耐藥性相關(guān)蛋白（multidrug resistance associ?ated protein，MRP）等膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的化療藥物外排、GST 同工酶介導(dǎo)的化療藥物外排、DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶介導(dǎo)的MDR表達(dá)水平改變、凋亡途徑相關(guān)基因表達(dá)下降等[23]。越來(lái)越多的研究證實(shí)MDR與Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路密切相關(guān)，這與其能間接影響MDR 及相關(guān)酶的表達(dá)水平有關(guān)。

Hu 等發(fā)現(xiàn)位于細(xì)胞質(zhì)的新抗氧化因子iASPP（inhibitor of apoptosis stimulating protein of p53）不依賴p53，而通過(guò)其N端DLT 氨基酸序列與Nrf2經(jīng)典DLG 序列競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Keap1的DGR 結(jié)構(gòu)域，提高Nrf2 蛋白穩(wěn)定性，激活Nrf2 抗氧化系統(tǒng)，促進(jìn)其抗氧化靶基因（如NQO1、HMOX1、FTH1）表達(dá)，顯著抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS 水平，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和耐藥[24]。Tian 等發(fā)現(xiàn)，在膽管癌細(xì)胞中，非典型的蛋白激酶Cι（aPKCι）能夠促進(jìn)Nrf2 累積、核轉(zhuǎn)移及激活相關(guān)目的基因表達(dá)，從而促進(jìn)膽管癌的腫瘤發(fā)生和化藥耐藥性，這種作用是通過(guò)aPKCι與Nrf2 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Keap1 中一個(gè)高度保守的DLL 結(jié)構(gòu)域來(lái)實(shí)現(xiàn)的[25]。另外，其他一些蛋白如PALB2、DPP3 等也都可通過(guò)與Nrf2 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Keap1 來(lái)促進(jìn)Nrf2 轉(zhuǎn)核，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在不利環(huán)境下的生存，增強(qiáng)其對(duì)化療藥物的耐藥性[26-27]。

這些研究結(jié)果表明，Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路與腫瘤耐藥性密切相關(guān)，藥物通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Keap1 或Nrf2 關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，激活Nrf2 并促進(jìn)其轉(zhuǎn)核，從而促使一些耐藥蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤的耐藥性。

5 基于Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路治療腫瘤的策略

化療在癌癥綜合治療中帶來(lái)的毒副作用和耐藥性是不容忽視的重要問(wèn)題。鑒于Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞耐藥性，抑制Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路已成為逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞耐藥的重要靶點(diǎn)之一。采用Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路抑制劑與抗癌藥聯(lián)用，增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)化療藥的敏感性，改善化療藥物的治療效果，為癌癥治療提供了新途徑。

呂慧等的研究證實(shí)，多柔比星（DOX）可以誘導(dǎo)K562細(xì)胞中Nrf2 蛋白累積，而聯(lián)合鴉膽子苦醇處理K562細(xì)胞可抑制Nrf2-Keap1 信號(hào)通路及其下游靶蛋白表達(dá)，進(jìn)而降低K562細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力，增強(qiáng)DOX誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡作用[28]。另外，從基因水平對(duì)Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路加以干擾或抑制，也可增敏腫瘤細(xì)胞。例如，研究發(fā)現(xiàn)一些miRNA可與此信號(hào)通路中Keap1 或Nrf2 相互作用，從而抑制此信號(hào)通路的激活。Chang 等發(fā)現(xiàn)miRNA-141 可能通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控Keap1 激活Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路，誘導(dǎo)抗氧化酶的表達(dá)，以降低細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，從而抑制乳腺癌細(xì)胞T47D的活力[29]。還有一種可能是利用人工合成某些小分子多肽作為誘導(dǎo)劑[18]，這些多肽可以特異性結(jié)合Keap1 中DGR 結(jié)構(gòu)域或者Nrf2 中DLG 或ETGE 結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，從而能破壞Keap1-Nrf2 復(fù)合物的穩(wěn)定性，促進(jìn)Nrf2與Keap1發(fā)生解離，進(jìn)而促使Nrf2 核異位促進(jìn)下游靶基因的表達(dá)。

6 結(jié)語(yǔ)

Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路在機(jī)體抵抗外源性物質(zhì)和氧化損傷方面發(fā)揮著重要的作用，越來(lái)越多的研究證實(shí)，Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。在癌癥治療中，Nrf2 有作為藥物靶點(diǎn)的巨大潛力，Nrf2誘導(dǎo)劑和NRF2 抑制劑都有望作為抗癌藥物發(fā)揮作用，其中一種可能是將Nrf2誘導(dǎo)劑或NRF2 抑制劑與傳統(tǒng)的抗癌藥物聯(lián)用[30]。但鑒于Keap1-Nrf2/ARE信號(hào)通路對(duì)腫瘤細(xì)胞的雙重作用，不同癌癥中Nrf2表達(dá)水平對(duì)癌癥的作用以及癌癥所處的發(fā)展階段都應(yīng)被考慮進(jìn)去[31]。長(zhǎng)期使用Nrf2誘導(dǎo)劑是否會(huì)促使正常細(xì)胞發(fā)生惡變目前也尚未有確切定論，需要通過(guò)更深入的研究驗(yàn)證。另外，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制十分復(fù)雜，可能涉及到多種機(jī)制共同作用，仍須進(jìn)行更廣泛的研究加以理解。相信隨著對(duì)Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路的不斷深入研究，其在抗腫瘤方面也會(huì)發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。