張麗霞 王一晶

癲癇是一種慢性腦功能障礙疾病，主要發(fā)病原因為大腦皮質(zhì)神經(jīng)元異常放電，其發(fā)病不僅對患者造成身體危害，還會導致患者發(fā)生認知功能障礙和心理功能障礙[1-2]。癲癇具有癲癇發(fā)作易感性的臨床特征，如經(jīng)臨床治療或多次治療仍未達到理想效果，則提示可能存在耐藥性的發(fā)生[3]。研究結果表明，在兒童癲癇患者中，因產(chǎn)生耐藥性而經(jīng)正規(guī)治療無效者占20%～30%[4]。主穹窿蛋白(major vault protein，MVP)是癲癇耐藥性機制研究中的一個熱點。研究發(fā)現(xiàn)，MVP可能是通過調(diào)控細胞核與細胞質(zhì)之間的物質(zhì)交換和囊泡運輸參與多藥耐藥的機制[5]，癲癇患者病變部位的血管內(nèi)皮細胞、神經(jīng)元以及腦組織中發(fā)現(xiàn)有MVP大量表達[6-7]。本研究通過檢測左乙拉西坦治療癲癇患者外周血MVP表達水平及認知功能的變化，旨在探討左乙拉西坦改善患者認知功能的可能機制。

1 對象和方法

1.1研究對象收集2013年1月至2016年1月作者醫(yī)院收治的經(jīng)口服左乙拉西坦治療的癲癇患者120例，其中男77例、女43例，年齡7～63歲、平均(35.1±6.1)歲；病程為2～10年、平均(6.7±3.1)年。入組標準：年齡4歲以上；經(jīng)臨床及腦電圖檢查確診為癲癇[8]；入組前3個月內(nèi)癲癇發(fā)作在2次以上并未接受抗癲癇藥物治療；患者未合并其他嚴重系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病及其他影響本研究觀察指標的疾病。排除標準：精神病史者、情緒極端者及其他原因?qū)е碌纳窠?jīng)認知功能異常者、依從性較差者、無法完成研究者或中途脫落者。所有患者及家屬知情同意。

1.2方法

1.2.1治療方案：給予患者口服左乙拉西坦口服溶液〔藥品名：開浦蘭，購自優(yōu)時比(珠海)有限公司，批準文號：H20160153，規(guī)格：10%(150 mL∶15 g)〕，以適量水吞服，服藥不受進食影響。按體重及年齡用藥：(1)針對體重50 kg以上且年齡在12歲以上的兒童及成人，起始治療劑量為500 mg，2次/d，根據(jù)治療效果和耐受性，可按照2～4周調(diào)節(jié)最高劑量為1500 mg/次，2次/d；(2)針對11歲以下兒童及體重在50 kg以下的12歲以上兒童，起始治療劑量按體重10 mg/kg，2次/d，根據(jù)治療效果及耐受性，每2周按體重10 mg/kg增加或減少，調(diào)整最高劑量為30 mg/kg；(3)兒童和體重≥50 kg的青少年，其劑量和成人一致；(4)對于年齡在65歲以上者，根據(jù)實際情況調(diào)節(jié)用藥劑量。治療時間為12個月，治療期間監(jiān)測患者的肝功能、血常規(guī)和電解質(zhì)等，若患者出現(xiàn)嚴重不適癥狀應當及時停止用藥。

1.2.2外周血MVP基因檢測：采用RT-PCR技術進行檢測。分別于用藥前、用藥6個月和用藥12個月時，于清晨抽取空腹外周血2 mL，分離細胞，應用Trizol試劑并按照說明書提取RNA。引物序列為：MVP基因：上游序列為5′-AGCTCAGCGGTACTTC-3′、下游序列為5′-GCCCGCGGGTCTCGAAC-3′；β-actin：上游序列為5′-GATTACTGCTCTGGCTCCTAGG-3′，下游序列為5′-GACTCATCGTACTCCT-GCTTGC-3′。擴增產(chǎn)物應用瓊脂糖凝膠電泳分析，并采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。應用紫外分光光度計測定260 nm、280 nm處吸光度〔D(λ)〕值。按下列公式計算RNA純度：RNA純度=D(λ)260 nm/D(λ)280 nm，數(shù)值范圍在1.7～2.0有效；按下列公式計算RNA濃度：RNA濃度(μg/μL)=4×D(λ)260 nm。

1.2.3外周血MVP蛋白檢測：采用Western-blot法進行檢測。分別于用藥前、用藥6個月和用藥12個月時，于清晨抽取空腹外周血2 mL，使用RIPA裂解液提取包膜蛋白，制備7%(質(zhì)量濃度)SDS-PAGE凝膠，加樣電泳，待溴酚藍電泳至分離膠底部時結束電泳。采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，將硝酸纖維素膜浸入含1 g脫奶粉的20 mL緩沖液封閉液中，置水平搖床上，溫室封閉2 h，然后用緩沖液清洗3次，每次5 min；用封閉液配置一抗孵育，4℃過夜。第2天復溫30 min，用緩沖液清洗3次，每次5 min；放入用堿性磷酸酶標記的二抗IgG，室溫2 h。緩沖液清洗3次，雙蒸水清洗1次，化學顯色后將光片采用Bio-Rad2000型凝膠成像系統(tǒng)掃描后，應用Quantity One軟件分析其灰度值，計算MVP蛋白條帶與β-actin灰度值的比值表示MVP蛋白相對表達量。

1.2.4認知功能檢測：于用藥前、用藥6個月和用藥12個月應用韋氏智力量表對患者的認知功能進行評分，包括總智商、語言智商以及操作智商等，短時記憶采用短時視覺記憶進行評分。檢測時應保證每組所處的時間、空間和外部環(huán)境一致。

1.3統(tǒng)計學處理采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差示，多組均數(shù)比較采用重復測量的方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

120例患者均完成各指標觀察和檢測，無脫落、中止和死亡病例。

2.1患者外周血MVPmRNA和MVP蛋白表達比較用藥6個月和用藥12個月時外周血MVP mRNA表達水平和MVP蛋白相對表達水平均較用藥前降低(均P<0.05)，且用藥12個月時外周血MVP mRNA表達水平和MVP蛋白相對表達水平低于用藥6個月時(均P<0.05)。結果見表1、圖1。

表1 癲癇患者用藥不同時間外周血MVP mRNA和MVP蛋白表達比較

注：MVP：主穹窿蛋白，圖1同；與用藥前比較，aP<0.05；與用藥6個月比較，bP<0.05

圖1 癲癇患者治療不同時間外周血MVP蛋白表達(Western blot)

2.2各組患者認知功能評分用藥12個月后，患者總智商、語言智商、操作智商及短時視覺記憶評分較用藥前和用藥6個月后均有改善(均P<0.05)，而用藥6個月上述評分與用藥前比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。結果見表2。

表2 各組癲癇患者認知功能評分比較

注：與用藥前和用藥6個月分別比較，aP<0.05

2.3不良反應患者治療期間出現(xiàn)情緒激動5例、嗜睡3例、心悸2例、頭暈3例、惡心2例，上述不良反應均在患者的耐受及可控范圍內(nèi)，未給予特殊處理。

3 討論

MVP是目前發(fā)現(xiàn)的與癲癇聯(lián)系密切的耐藥基因之一，首次發(fā)現(xiàn)于大鼠肝組織標本中。MVP不僅參與正常生理功能過程，還參與多種病理狀態(tài)的發(fā)生發(fā)展，如腫瘤、癲癇和血液病等[9]。MVP作為一種胞質(zhì)蛋白顆粒，能與進入胞質(zhì)中的藥物形成囊泡，并通過胞吐作用排出細胞，導致靶點藥物有效濃度降低而產(chǎn)生耐藥[10]；此外，MVP還可能通過改變藥物在細胞內(nèi)的分布，使藥物呈房室性分布，在胞內(nèi)隔離藥物，導致藥物與細胞內(nèi)作用靶點隔離而產(chǎn)生耐藥[11]。有學者在38例難治性癲癇患者手術切除的額葉致癇灶皮質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了MVP的陽性表達[12]，亦有研究在癲癇患者腦組織中發(fā)現(xiàn)MVP大量表達，其被認為是導致抗癲癇藥物治療失敗的一個因素，推測MVP可能參與癲癇耐藥的形成[13]。

左乙拉西坦屬于吡咯烷酮衍生物，短期通過抑制細胞內(nèi)鈣離子(Ca2+)水平調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞興奮性，長期療效則通過特異性結合突觸囊泡蛋白SV2A，降低神經(jīng)遞質(zhì)釋放，并阻止癲癇發(fā)作。在局限性和全面性癲癇發(fā)作的動物模型中，左乙拉西坦具有神經(jīng)保護作用，并開始用于兒童癲癇的治療[14-15]。研究結果顯示，左乙拉西坦在控制青少年癲癇發(fā)作的同時，可部分改善患者的認知功能[16]。本研究結果顯示，癲癇患者經(jīng)左乙拉西坦治療12個月后，患者總智商、語言智商、操作智商及短時視覺記憶評分較用藥前和用藥6個月后均有顯著改善，且用藥期間未發(fā)現(xiàn)嚴重并發(fā)癥，提示長期服用左乙拉西坦能有效改善癲癇患者的認知功能，且安全性較高，可能利于癲癇的病情控制。

生理狀態(tài)下，MVP基因及MVP蛋白存在微量表達，是組織器官正常生理代謝產(chǎn)物。本研究結果顯示，經(jīng)左乙拉西坦治療后患者外周血MVP mRNA及其蛋白表達量均較用藥前降低，且用藥12個月后MVP mRNA和MVP蛋白表達量低于用藥6個月，表明左乙拉西坦并非MVP底物，但能降低MVP的表達而改善癲癇認知功能障礙。

綜上所述，應用左乙拉西坦能有效改善癲癇患者認知功能，其作用機制可能與下調(diào)MVP的表達有關。由于本研究未對用藥人群的年齡、用藥劑量以及體重等進行多因素的校正，因此左乙拉西坦對癲癇患者認知功能的確切療效及機制尚需進一步研究。