林冬融 揭育東 韓江全

腦梗死是中老年人常見病及多發(fā)病，其致殘率高，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。細胞凋亡已被公認是腦梗死眾多發(fā)病機制中的重要一環(huán)，以凋亡為主要病理變化的腦缺血半暗帶面積大小直接決定患者預(yù)后。近年來研究表明細胞凋亡亦是糖尿病加重腦缺血再灌注損傷的重要機制之一[1]。尤瑞克林即人尿激肽原酶，是我國科研工作者研發(fā)的一種治療急性缺血性腦血管病藥物，它可以選擇性擴張缺血區(qū)腦血管，減輕神經(jīng)細胞損傷，抑制神經(jīng)細胞凋亡以及促進內(nèi)源性神經(jīng)再生[2]。本研究通過動物實驗?zāi)M糖尿病大鼠腦缺血再灌注損傷的病理生理過程，探討尤瑞克林對糖尿病合并急性腦缺血再灌注損傷神經(jīng)細胞的保護機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物與分組選取8周齡健康雄性SD大鼠82只，體重250～300 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。大鼠置室溫25℃，潔凈通風(fēng)環(huán)境下飼養(yǎng)。以簡單隨機數(shù)字法分為尤瑞克林組(n=36只)、缺血組(n=36只)和假手術(shù)組(n=10只)，尤瑞克林缺血組和缺血組再隨機分為腦缺血2 h再灌注12、24和48 h亞組，每亞組12只。

1.2方法

1.2.1糖尿病模型制作：SD大鼠均于實驗前8 h禁食，6 h禁水。術(shù)前30 min新鮮配制濃度為5 mg/mL無菌鏈脲佐菌素(STZ)溶液。常規(guī)消毒后，按體重2 mg/100 g給予大鼠左下腹腔注射STZ，24 h后再次按體重3.5 mg/100 g注射STZ。術(shù)后自由進水進食。7 d后以微機血糖儀測定大鼠尾尖外周血血糖，非空腹血糖16.7～25.6 mmol/L為糖尿病造模成功。所有大鼠均造模成功。

1.2.2大腦中動脈阻塞再灌注(MCAO/R)大鼠模型制備：參照Zea-Longa法制作MCAO/R模型。以線體直徑0.26 mm，線頭直徑0.36 mm的成品栓線栓塞大鼠右側(cè)頸內(nèi)動脈2 h，抽出栓線實現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組按相同步驟切開及分離頸總動脈、頸外動脈后重新縫合皮膚，不插入栓線。尤瑞克林組大鼠于再灌后30 min給予舌下靜脈注射尤瑞克林(8.75×10-3PNA單位/kg)，缺血組給予等量生理鹽水，假手術(shù)組不進行注射。將大鼠放入鼠籠中飼養(yǎng)，自由飲食，室溫保持在25℃。造模過程中缺血組1只大鼠因麻醉過量死亡，尤瑞克林組1只大鼠取腦時發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血給予排除。按隨機原則補充2只。

1.2.3神經(jīng)功能評分：分別于再灌注12、24和48 h各時間點處死大鼠前按照Bederson 6級5分制法進行神經(jīng)功能評分。0分：無神經(jīng)功能缺損；1分：對側(cè)上肢不能完全伸展；2分：對側(cè)肢體抵抗力下降；3分：提尾時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；4分：行走時自動轉(zhuǎn)圈；5分：對刺激無反應(yīng)，無自發(fā)性活動。評分≥2分表示MACO/R造模成功。

1.2.4腦標(biāo)本制備：按腦缺血再灌注12、24和48 h處死大鼠，斷頭取腦，腦組織置4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛液中固定24 h后，在視交叉后2～7 mm處垂直切取冠狀切片，腦片厚度約5 mm，放入厚度與之相適應(yīng)的石蠟包埋網(wǎng)盒備用。

1.2.5凋亡細胞數(shù)檢測：采用原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL法)檢測細胞凋亡數(shù)目，嚴格按照細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作。細胞核具有凋亡形態(tài)學(xué)特征且有棕黃色顆粒者為陽性凋亡細胞。隨機選取腦缺血半暗帶皮層組織內(nèi)5個不相重復(fù)的視野，計算陽性凋亡細胞數(shù)目，取其平均值。

1.2.6caspase-12表達檢測：采用免疫組化檢測大鼠腦缺血半暗帶皮層組織caspase-12表達。具體操作嚴格按照免疫組化檢測試劑盒(S-P法)說明書進行。Ⅰ抗為caspase-12 Rabbit mAb。細胞胞質(zhì)呈棕黃色者為陽性細胞。以MiVnT顯微生物圖像分析系統(tǒng)對圖片進行分析，以平均灰度級表示陽性細胞率，平均灰度級值越低，表明染色越深，陽性細胞率越高。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組均數(shù)間比較應(yīng)用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK檢驗。取α=0.05。

2 結(jié)果

2.1大鼠外周血血糖測定MACO/R造模前假手術(shù)組、缺血組及尤瑞克林組平均血糖分別為(21.11±1.70)、(21.09±2.67)、(20.72±2.78)mmol/L，3組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(F=0.210，P=0.811)。

2.2神經(jīng)功能評分假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能評分均為0分，未見神經(jīng)功能缺損，另2組大鼠出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)。尤瑞克林組神經(jīng)功能缺損評分低于缺血組(P<0.05)；缺血組及尤瑞克林組大鼠于再灌注24、48 h神經(jīng)功能缺損評分均高于再灌注12 h時間點(P<0.05)。結(jié)果見表1。

2.3各組凋亡細胞數(shù)比較假手術(shù)組可見少量凋亡細胞，另2組大鼠缺血半暗帶中均可見大量凋亡細胞。缺血組及尤瑞克林組大鼠于再灌注24、48 h凋亡細胞數(shù)均高于再灌注12 h時間點(P<0.05)；尤瑞克林組凋亡細胞數(shù)低于缺血組(均P<0.05)。結(jié)果見表2、圖1。

2.4各組大鼠腦組織caspase-12表達假手術(shù)組腦組織caspase-12表達極低，另2組大鼠缺血半暗帶中均可見caspase-12高表達。缺血組及尤瑞克林組大鼠于再灌注24、48 h的 caspase-12表達均高于再灌注12 h(P<0.05)。與假手術(shù)組比較，缺血組和尤瑞克林組大鼠腦組織caspase-12表達升高(均P<0.01)，且尤瑞克林組caspase-12表達水平均低于缺血組(P<0.05)。結(jié)果見表3、圖2。

表1 各組大鼠腦缺血再灌注不同時間神經(jīng)功能評分比較

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與缺血組比較，bP<0.05；與同組12 h比較，cP<0.05；—：未進行統(tǒng)計學(xué)分析

表2 各組大鼠腦缺血再灌注不同時間點腦組織凋亡細胞計數(shù)比較

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與缺血組比較，bP<0.05；與同組12 h比較，cP<0.05

注：細胞核內(nèi)有棕黃色顆粒為TUNEL染色陽性細胞，細胞核呈藍色為正常細胞 圖1 各組大鼠腦缺血再灌注后不同時間腦缺血半暗帶皮層組織凋亡細胞比較(TUNEL 染色，×400)

3 討論

糖尿病是缺血性腦血管病的獨立危險因素，高血糖狀態(tài)可加重急性腦梗死發(fā)生后的腦損傷。國內(nèi)外相關(guān)研究證實[1]，細胞凋亡在高血糖加重腦缺血再灌注損傷的眾多機制中起著至關(guān)重要的作用，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑則是3條經(jīng)典的細胞凋亡途徑之一[3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細胞中蛋白質(zhì)翻譯、合成和鈣離子的存儲場所，缺血、缺氧等各種外在條件刺激下，可引起其功能障礙，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)發(fā)生。缺血缺氧的早期，ERS可糾正錯誤折疊蛋白或使未折疊蛋白重新恢復(fù)正常，但隨應(yīng)激時間逐漸延長及應(yīng)激反應(yīng)的逐漸增強，則引起細胞凋亡。caspase-12存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜，是caspase家族成員之一，caspase-12作為ERS介導(dǎo)的固有凋亡蛋白，與其他的caspase家族成員一樣在生理條件下以無活性酶原形式存在，僅在ERS時才能被活化，非內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的凋亡途徑無caspase-12表達[4-5]。實驗研究發(fā)現(xiàn)，caspase-12缺陷大鼠僅能抵抗ERS介導(dǎo)的細胞凋亡，而對其他死亡因子的刺激仍可引發(fā)細胞凋亡，充分證實caspase-12是ERS誘導(dǎo)凋亡機制的特異性因子[6]。本課題組前期有關(guān)糖尿病加重腦缺血再灌注損傷的細胞凋亡途徑研究中，通過對比正常血糖組及高血糖組大鼠腦缺血再灌注后caspase-12表達的變化發(fā)現(xiàn)，與正常血糖組比較，高血糖組大鼠腦缺血半暗帶中caspase-12表達顯著增強，提示caspase-12介導(dǎo)的ERS可能是糖尿病加重腦缺血再灌注損傷的機制之一[7]。

表3 各組大鼠腦缺血再灌注不同時間點腦組織caspase-12表達比較

注：表中數(shù)據(jù)為灰度級數(shù)值，其值越高表示caspase-12表達水平越低；與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與缺血組比較，bP<0.05；與同組12 h比較，cP<0.05

注：細胞質(zhì)呈棕黃色為陽性細胞，細胞結(jié)構(gòu)較為完整且胞核呈藍色者為正常細胞 圖2 各組大鼠腦缺血再灌注不同時間點腦組織缺血半暗帶皮層caspase-12表達(免疫組化，×400)

尤瑞克林是從人類尿液中提取的一種由238個氨基酸組成的絲氨酸蛋白酶，能催化激肽原水解產(chǎn)生激肽，后者及其進一步降解產(chǎn)物能與缺血部位血管細胞產(chǎn)生的 B1 受體結(jié)合發(fā)揮擴張微動脈的作用。因 B1 受體僅在組織受缺血損傷后由損傷的組織血管內(nèi)皮細胞誘導(dǎo)生成，故尤瑞克林可選擇性擴張缺血區(qū)腦血管，提高缺血部位腦組織血流量，改善腦組織對氧的攝取[2，8]。近年來多項研究顯示，尤瑞克林的腦保護作用與多個凋亡相關(guān)因子有密切關(guān)系，可通過上調(diào)Bcl-2表達，下調(diào)caspase-3、Fas-L蛋白、Bax蛋白表達，抑制p38MAPK活化等，從而抑制神經(jīng)細胞凋亡，促進內(nèi)源性神經(jīng)再生[9-11]，改善神經(jīng)功能缺損癥狀[12]，并被推薦用于缺血性腦血管病急性期治療[13]。同時，在臨床療效觀察中，對急性腦梗死合并2型糖尿病患者采用美國國立衛(wèi)生研究院腦卒中量表(NIHSS評分)、改良Rankin scale(mRS評分)及日常生活能力量表(ADL評分)評定尤瑞克林治療組和對照組患者療效，表明尤瑞克林治療2型糖尿病并發(fā)急性腦梗死療效顯著[14-15]，但其保護機制尚未明確。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)尤瑞克林干預(yù)的大鼠于腦缺血再灌注后12、24和48 h其神經(jīng)功能評分及腦缺血半暗帶凋亡細胞數(shù)和caspase-12表達均低于缺血組，表明尤瑞克林對糖尿病大鼠腦缺血再灌注后的神經(jīng)功能缺損具有保護作用，其保護機制可能是通過抑制缺血半暗帶中的神經(jīng)細胞凋亡實現(xiàn)，caspase-12可能參與了尤瑞克林對糖尿病大鼠腦缺血再灌注損傷的保護機制。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，尤瑞克林組大鼠腦缺血再灌注12、24、48 h神經(jīng)功能評分、細胞凋亡數(shù)及caspase-12均低于缺血組，表明尤瑞克林對糖尿病大鼠局灶性腦缺血再灌注后神經(jīng)功能缺損具有保護作用，其作用機制可能是通過下調(diào)caspase-12表達從而抑制細胞凋亡有關(guān)。