周佳君 羅漣 陳智才

視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病(neuromyelitis optical spectrum disorders，NMOSD)是一組主要由體液免疫參與、抗原-抗體介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘疾病譜[1]。自2004年Lennon等在視神經(jīng)脊髓炎(NMO)患者血清中發(fā)現(xiàn)水通道蛋白4(AQP4)抗體后，NMO被認(rèn)為是一種與多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)不同的獨立疾病[2]。血清胱抑素C(cystatin C，Cys C)是體內(nèi)半胱氨酸組織蛋白酶(cathepsins， Cat)內(nèi)源性抑制劑，研究結(jié)果顯示Cys可調(diào)節(jié)Cat的免疫應(yīng)答作用及其對髓鞘基質(zhì)蛋白的降解[3-4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，Cys C在MS中及其他免疫介導(dǎo)的神經(jīng)疾病中異常表達(dá)[3，5]，而其與NMOSD的關(guān)系尚不清楚。本研究通過觀察NMOSD患者血清Cys C水平的變化，旨在探討血清Cys C與NMOSD臨床特征的相關(guān)性。

1 對象和方法

1.1觀察對象回顧性收集2015年9月至2018年5月就診于作者醫(yī)院的NMOSD患者37例、MS 20例。(1)NMOSD組：男5例，女32例，年齡22～71歲，平均(42.91±12.04)歲。均符合2015年國際NMO診斷小組制定的NMOSD診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，均為急性期(首次發(fā)作或復(fù)發(fā)1個月以內(nèi))。(2)MS組：男8例，女性12例，年齡26～83歲，平均(40.35±11.04)歲。均符合2011年McDonald診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，均為急性期(首次發(fā)作或復(fù)發(fā)1個月以內(nèi))。(3)健康對照組：另選擇作者醫(yī)院同一時期健康體檢者43名作為對照組，其中男21名，女22名，年齡26～71歲，平均(43.72±11.19)歲。所有入組對象均有腎小球濾過率及血清肌酐水平檢測結(jié)果，以觀察其對Cys C水平的影響。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在有其他原因所致的有關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和體征；伴發(fā)腫瘤、血液疾病及合并肝腎障礙疾病患者。

1.2方法

1.2.1血清Cys C測定：清晨空腹取外周靜脈血2 mL，靜置1 h左右，以4000 r/min 4℃離心10 min，分離血清。采用免疫比濁法檢測Cys C水平。血清Cys C試劑盒購于羅氏公司，檢測方法與步驟嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。檢測儀為羅氏P800生化儀。血清Cys C濃度正常參考范圍<1.03 mg/L。

1.2.2神經(jīng)功能缺損評分：詳細(xì)詢問病史及體格檢查，采用擴(kuò)展殘疾狀態(tài)量表(expanded disability status scale，EDSS)評價NMOSD組和MS組的神經(jīng)功能缺損程度。

1.2.3影像學(xué)檢查：所有NMOSD患者入院后均進(jìn)行MRI影像學(xué)檢查了解脊髓病灶節(jié)段和頭顱病灶情況，使用美國通用公司GE1.5T核磁共振進(jìn)行平掃，包括頭顱和脊髓的 T1、T2、FLAIR及彌散加權(quán)成像掃描。

1.2.4血清AQP4抗體檢測：采用間接免疫熒光法檢測NMOSD及MS患者血清AQP4抗體。AQP4抗體試劑盒購于德國EUROIMMUN AG公司(FA 1128)，具體檢測方法與步驟嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩均數(shù)間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Scheffe法；非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示，兩組間比較采用Mann-Whitney秩和檢驗，多組間比較采用Kruskal Wallis秩和檢驗；計數(shù)資料分析用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1臨床特點NMOSD組初次發(fā)病患者9例，復(fù)發(fā)28例，病程0.10～20.00年，中位數(shù)3.75年，四分位數(shù)間距5.75年；33例行血清AQP4抗體檢測，其中21例陽性；EDSS評分1～8分，中位數(shù)5.0分，四分位數(shù)間距4.0分。MS組患者初次發(fā)病患者3例，復(fù)發(fā)17例，病程0.50～15.00年，中位數(shù)3.10年，四分位數(shù)間距4.80年；19例行血清AQP4檢測，1例陽性；EDSS評分1～8分，中位數(shù)3.5分，四分位數(shù)間距4.0分。3組在年齡、腎小球濾過率及血清肌酐水平比較無統(tǒng)計學(xué)差異(均P>0.05)。結(jié)果見表1。

2.2各組血清CysC水平比較MMOSD組、MS組和對照組血清Cys C水平分別為(0.83±0.12)、(0.86±0.10)和(0.91±0.10)mg/L，3組間血清Cys C水平比較有統(tǒng)計學(xué)差異(F=5.48，P=0.006)。兩兩比較結(jié)果顯示，NMOSD組血清Cys C水平低于對照組(P=0.006)，而與MS組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，MS組血清Cys C水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見圖1。

表1 各組臨床資料比較

注：NMOSD：視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病，MS：多發(fā)性硬化；圖1同。EDSS：擴(kuò)展殘疾狀態(tài)量表；AQP4：水通道蛋白4抗體；a數(shù)據(jù)以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示；b33例NMOSD患者行AQP4抗體檢測；c19例MS患者行AQP4抗體檢測；-：無數(shù)據(jù)

注：Cys C：胱抑素； aP<0.01 圖1 各組間血清Cys C水平比較

2.3NMOSD患者CysC水平與臨床特征的關(guān)系EDSS≥5分的重度神經(jīng)功能缺損NMOSD患者(n=21)血清Cys C水平低于EDSS<5分的輕度神經(jīng)功能缺損者〔n=16，(0.78±0.10)mg/L比(0.88±0.12)mg/L；t=2.98，P<0.01〕。影像學(xué)檢查顯示存在顱內(nèi)病灶的NMOSD患者(n=17)血清Cys C水平低于無顱內(nèi)病灶者〔n=20，(0.77±0.11)mg/L比(0.87±0.12)mg/L；t=2.81，P<0.01〕。AQP4抗體陽性組(n=21)血清Cys C水平與陰性組(n=12)比較無統(tǒng)計學(xué)差異〔(0.81±0.11)mg/L比(0.83±0.12)mg/L；t=0.34，P>0.05〕。男性NMOSD患者(n=5)血清Cys C水平與女性患者比較無統(tǒng)計學(xué)差異〔n=32，(0.82±0.18)mg/L比(0.82±0.11)mg/L；t=0.24，P>0.05〕。病程≥3年NMOSD患者(n=18)血清Cys C水平與病程<3年者(n=19)相比無統(tǒng)計學(xué)差異〔(0.84±0.11)mg/L比(0.81±0.13)mg/L；t=0.81，P>0.05〕。脊髓受累范圍≥3個節(jié)段的NMOSD患者(n=29)與<3個節(jié)段患者(n=8)血清Cys C水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義〔(0.82±0.12)mg/L比(0.80±0.99)mg/L；t=0.60，P>0.05〕。

3 討論

Cys C為機(jī)體內(nèi)源性Cat抑制劑，其生成速度穩(wěn)定，不受炎性因子、飲食、三酰甘油、血糖等影響，并與性別和肌肉量無關(guān)，目前臨床上主要用于早期腎功能受損的檢測[7]。近幾年來，越來越多研究發(fā)現(xiàn)Cys C還在免疫、細(xì)胞氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)中起重要作用[8]，其不僅參與腦血管動脈粥樣硬化、腦炎的發(fā)病，還與吉蘭-巴雷綜合征和MS有關(guān)[3，5，9]，而其與NMOSD的關(guān)系仍未明確。本研究中NMOSD、MS及對照組血肌酐水平及腎小球濾過濾比較無統(tǒng)計學(xué)差異，表明3組在腎臟功能方面比較并無統(tǒng)計學(xué)差異，避免了腎功能對Cys C水平的干擾，結(jié)果顯示，NMOSD患者急性期血清Cys C水平低于對照組，提示血清Cys C水平與NMOSD發(fā)生可能有關(guān)。既往國內(nèi)文獻(xiàn)報道，中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病患者(包含NMO及MS)血清Cys C水平高于健康對照組[10]，但上述研究未能區(qū)分急性期與緩解期的差異。最近Shu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)期NMOSD患者血清Cys C水平低于健康對照組，這與本研究結(jié)果相符；另外，Shu等[11]研究結(jié)果還顯示NMOSD復(fù)發(fā)期血清Cys C水平低于緩解期，而緩解期血清Cys C水平則高于健康對照組，Cys C在NMOSD中的這種動態(tài)變化提示Cys C可能還參與了疾病的活動。

Cys C在NMOSD的作用目前尚未清楚，作為Cat的內(nèi)源性抑制劑，其主要生理功能是調(diào)節(jié)Cat類特別是溶酶體內(nèi)組織蛋白酶的活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外蛋白水解酶水平，抑制細(xì)胞外的蛋白水解酶，使細(xì)胞免受蛋白酶水解，參與細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生與降解、血管壁蛋白酶與抗蛋白酶的動態(tài)平衡[4]。研究結(jié)果顯示，Cat可通過降解髓鞘基質(zhì)蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病中發(fā)揮作用[12]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，Cat B在MS患者腦組織、腦脊液及外周血單核細(xì)胞中顯著高表達(dá)，而其腦脊液Cys C水平則明顯下降，提示Cat/Cys C平衡失調(diào)在脫髓鞘變性中發(fā)揮了作用[5，13]。作者推測NMOSD患者Cys C水平下降可能導(dǎo)致Cat活躍，引起或加重髓鞘蛋白的降解，進(jìn)而引起疾病發(fā)生或復(fù)發(fā)。其次，Cat通過降解血管壁基質(zhì)，參與了血-腦脊液屏障損傷，Cat的升高可影響血-腦脊液屏障通透性[14]，如有研究發(fā)現(xiàn)NMO的發(fā)病機(jī)制與外周血抗AQP4抗體經(jīng)過破壞的血-腦脊液屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起免疫反應(yīng)密切相關(guān)[15]。本研究結(jié)果顯示，存在顱內(nèi)病灶的NMOSD患者Cys C水平低于無顱內(nèi)病灶患者，推測血清Cys水平的降低、Cat的活躍可能加重血-腦脊液屏障的破壞，導(dǎo)致血清抗AQP4抗體進(jìn)入顱內(nèi)，引起NMOSD顱內(nèi)損傷。第三，NMOSD患者Cys C水平降低可能與其本身具有抗氧化應(yīng)激作用有關(guān)[16]，NMOSD患者血-腦脊液屏障遭到破壞，可導(dǎo)致大量炎性反應(yīng)因子進(jìn)入腦內(nèi)，腦內(nèi)炎性反應(yīng)引起的氧自由基增多可導(dǎo)致Cys C消耗增加，進(jìn)而引起血清Cys C水平降低。

本研究結(jié)果還顯示，NMOSD患者血清Cys C水平與臨床神經(jīng)功能缺損程度相關(guān)，EDSS≥5分的NMOSD患者血清Cys C水平低于EDSS <5分者，表明血清Cys水平與NMOSD患者疾病嚴(yán)重程度有關(guān)，提示低血清Cys C可能是NMOSD病情嚴(yán)重程度或疾病活動的標(biāo)志。Ma等[17]采用中樞脫髓鞘疾病小鼠模型研究揭示，急性期小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生Cat S，而星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生Cys C，髓鞘脫離后的殘片由小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞清除，從而有利于髓鞘的修復(fù)再生，Cat/Cys C比例失衡可阻礙脫髓鞘后神經(jīng)的再生修復(fù)[17]，繼而影響神經(jīng)功能。Gajofotto等[18]臨床研究發(fā)現(xiàn)，伴脊髓受累的臨床孤立綜合征患者腦脊液Cys C水平與EDSS評分呈正相關(guān)，患者EDSS評分越高，Cys C水平越高。上述研究均提示Cys C水平與脫髓鞘疾病神經(jīng)功能預(yù)后密切有關(guān)。

本研究中MS患者血清Cys C水平與對照組相比有降低趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異，NMOSD患者與MS患者Cys C水平比較亦未見統(tǒng)計學(xué)差異，提示Cys C可能不是鑒別MS與NMOSD的合適血清標(biāo)志物。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，急性期NMOSD患者血清Cys C水平較正常對照組下降，與MS患者相比無統(tǒng)計學(xué)差異；急性期NMOSD患者血清Cys C水平與病情嚴(yán)重程度及顱內(nèi)病灶有關(guān)。低血清Cys C水平可能是NMOSD患者顱內(nèi)受累的危險因素。但本研究樣本量少，為回顧性研究，納入對象為急性期，未對NMOSD患者進(jìn)行動態(tài)觀察，未對腦脊液Cys C水平進(jìn)行檢測，因此，有關(guān)Cys C水平在NMOSD發(fā)病中的確切作用需進(jìn)一步研究。