， ，保和，

1 材料與方法

1.1 實驗材料 96孔白板、96孔黑板、20 μL槍頭、200 μL槍頭、1 mL槍頭、5 mL槍頭、加樣槽、試管架、棉球、酒精燈、移液器、50 mL離心管。

1.2 實驗試劑 磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、平衡鹽溶液、雙抗(PS)、血清(FBS)、DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibcal)、過氧化氫(H2O2)、Cell Counting Kit-8(日本同仁)、Mito Tracker4?Deep Red(Invitrogen，Eugene，USA，22624)、Hoechst33342(Invitrogen，Eugene，USA，H1399)、FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I(BD Pharmingen，556547)

1.3 實驗儀器 FlexStation 3(MD，美國)，高內(nèi)涵儀器(PE，美國)，Opretta system。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養(yǎng) 將提取成功且純度達90%的原代乳鼠心肌細胞接種于96孔白色培養(yǎng)板和96孔黑色培養(yǎng)板，接種細胞密度為3×104個/孔，每孔加入含5%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基100 μL，置于CO2孵箱正常培養(yǎng)72 h后用于實驗。

1.4.2 分組及造模 將H2O2原液用PBS配制成10 μmol/L的母液，再用DMEM/F12 培養(yǎng)基將母液配制成不同濃度溶液并加入白色細胞培養(yǎng)板，每孔100 μL。濃度分組，A組：DMEM/F12(control)；B組：100 μmol/L；C組：200 μmol/L；D組：300 μmol/L；E組：400 μmol/L；F組：500 μmol/L；G組：600 μmol/L；H組：700 μmol/L；I組：800 μmol/L；J組：1 000 μmol/L；每組4個復孔，造模2 h后吸去H2O2待測。

1.4.3 細胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)檢測造模后的心肌細胞活力 按照說明書使用CCK-8試劑盒，按1∶10比例稀釋CCK-8試劑，避光，每孔100 μL加入細胞，孵箱培養(yǎng)2 h后用酶標儀檢測吸光度值(OD值)，計算細胞活力。

1.4.4 凋亡試劑盒檢測造模后的心肌細胞凋亡情況 使用黑色培養(yǎng)板，選取適當?shù)腍2O2濃度對培養(yǎng)3 d的心肌細胞進行造模2 h后染色。熒光染料分別為：Hoechst33342(Invitrogen，Eugene，USA，H1399)，1 μg/mL；Mito Tracker?Deep Red(Invitrogen，Eugene，USA，22624)，0.1 μmol/L；FITC Annexin V(BD Pharmingen，51-65874X)，1 μg/mL；Propidium Iodide Staining Solution(BD Pharmingen，51-66211E)，1 μg/mL；用DMEM/F12配制后，分別在每孔加50 μL，在37 ℃環(huán)境下孵育20 min。PBS洗3遍，每孔150 μL，每次5 min。最后加100 μL Annexin V Binding Buffer (BD Pharmingen，51-66121E)進行高內(nèi)涵掃描。所有操作均在避光條件下進行。

設置合適的曝光時間和讀板高度，設定陽性細胞大小和熒光強度閾值，選取要讀板的孔和視野(保證各組實驗以及重復實驗選取的視野數(shù)目一致)，進行掃板，得出細胞總數(shù)、死細胞數(shù)目、早期凋亡比例、晚期凋亡比例和染料熒光強度。

滿足廣大農(nóng)村地區(qū)讀者的閱讀需求是新聞出版公共服務體系的重點之一。到2017年，我國已建成農(nóng)家書屋60萬個，覆蓋了全國具備基本條件的行政村，建成數(shù)字農(nóng)家書屋3.5萬個，城鄉(xiāng)閱報欄（屏）10萬個，形成了形式多樣、內(nèi)容豐富的立體傳播體系。

1.5 統(tǒng)計學處理 使用SPSS分析并處理數(shù)據(jù)，GraphPad Prism 5軟件繪制圖表并計算半數(shù)有效濃度(EC50)。

2 結(jié) 果

2.1 心肌細胞活性 不同濃度H2O2誘導凋亡后心肌細胞活力見圖1。使用GraphPad Prism 5軟件計算EC50為320 μmol/L，詳見圖2。選取EC50前后各一個H2O2濃度及EC50濃度使用高內(nèi)涵技術(shù)進行進一步檢測，其中EC50濃度選取配制容易且可精確配制的350 μmol/L濃度。此時選取其近似濃度300 μmol/L、350 μmol/L、400 μmol/L設定高中低劑量進行高內(nèi)涵檢測。

2.2 心肌活細胞個數(shù) 350 μmol/L、400 μmol/L濃度的H2O2處理后心肌細胞個數(shù)均減少(P<0.05或P<0.01)，詳見圖3。

2.3 心肌細胞細胞核面積 350 μmol/L、400 μmol/L濃度的H2O2處理后心肌細胞細胞核面積均顯著縮小(P<0.01)，見圖4。

各劑量組與control組比較，*P<0.01

圖2 細胞活性曲線圖

各劑量組與control組比較，*P<0.05；#P<0.01

各劑量組與control組比較，*P<0.01

2.4 心肌細胞細胞質(zhì)損傷情況 3個濃度的H2O2均對Mito Tracker染色的細胞質(zhì)具有明顯損傷(P<0.01)。詳見圖5。

2.5 心肌細胞凋亡細胞比例 300 μmol/L濃度的H2O2誘導細胞凋亡模型最理想，高內(nèi)涵篩選計算早期凋亡細胞占61.4%，晚期凋亡細胞占38.2%。3個濃度的H2O2誘導早期凋亡細胞比例均明顯增多(P<0.01)。詳見圖6。400 μmol/L濃度的H2O2誘導晚期凋亡細胞比例增多(P<0.05)。詳見圖7。

2.6 高內(nèi)涵熒光顯微成像情況 藍色染色標記活細胞核，正常細胞核為圓形或橢圓形，熒光著色淺，而凋亡細胞的細胞核固縮，呈弱熒光反應；深紅色染色為標記為線粒體的細胞質(zhì)，與正常細胞相比，凋亡細胞線粒體排列散亂，形態(tài)異常，熒光強度改變。綠色熒光強度可顯示早期凋亡細胞，黃色熒光強度可顯示晚期凋亡細胞，熒光強度均較對照組強且數(shù)量多。詳見圖8。

各劑量組與control組比較，*P<0.01

各劑量組與control組比較，*P<0.01

各劑量組與control組比較，*P<0.05

圖8 高內(nèi)涵熒光顯微成像圖片

3 討 論

3.1 H2O2誘導心肌細胞凋亡造模分析 CCK-8檢測結(jié)果表明200 μmol/L及以上濃度的H2O2即可抑制心肌細胞活性，誘導其凋亡，且400 μmol/L及以上劑量可極其明顯的抑制細胞活性，但CCK-8檢測方法不能直觀細胞存活情況及損傷程度，不能計算細胞個數(shù)、凋亡百分比等量化指標。

分析給藥后的細胞進行染色后掃板得出數(shù)據(jù)及顯微成像圖片，Hoechst染色為藍色，Mito Tracker染色為深紅色，綠色染色為FITC標記的膜聯(lián)素V，黃色染色為PI標記的細胞DNA。Hoechst可穿透細胞膜標記細胞核，顯示活細胞；Mito Tracker可標記線粒體，線粒體是較大的細胞器，故可顯示細胞質(zhì)；膜聯(lián)素V與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，可與細胞發(fā)生凋亡后翻向質(zhì)膜外側(cè)的磷脂酰絲氨酸結(jié)合使其顯色，可指示早期凋亡和壞死細胞；PI只能標記核破裂后溢出的DNA，可指示晚期凋亡和壞死細胞。4項指標綜合分析即可判斷細胞損傷程度和計算早期凋亡及晚期凋亡細胞比例。分析顯示3種濃度劑量的H2O2對心肌細胞均有不同程度的損傷，均可誘導心肌細胞凋亡，且隨著濃度劑量的升高，線粒體結(jié)構(gòu)改變明顯，細胞數(shù)減少，核面積減小，早期凋亡及晚期凋亡的心肌細胞均增多，檢測指標趨勢均較為明顯，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。300 μmol/L濃度的H2O2對原代心肌細胞損傷明顯，早期凋亡細胞占61.4%，晚期凋亡細胞占38.2%。由此可知，此劑量可造成細胞明顯的早期凋亡(P<0.01)，但尚不足以導致大量細胞晚期凋亡以至壞死，損傷尚可逆，故可選取300 μmol/L劑量用于誘導心肌細胞凋亡。

3.2 高內(nèi)涵檢測細胞凋亡可行性分析 本實驗研究使用FITC和PI雙標記細胞凋亡試劑盒對心肌細胞染色，此試劑盒多用于免疫熒光染色檢測細胞凋亡，應用較為成熟，但使用高內(nèi)涵檢測方法并不多見。Annexin V是一種檢測細胞凋亡的靈敏指標，因細胞發(fā)生凋亡或壞死時，其由質(zhì)膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)，且此過程可早于DNA碎片發(fā)生，因此，F(xiàn)ITC標記Annexin V結(jié)合Hoechst染色可顯示早期凋亡。PI可標記DNA碎片，結(jié)合Hoechst染色可顯示晚期凋亡[1]。本研究使用該試劑盒加用Hoechst和Mito Tracker染料進行染色，結(jié)果比CCK-8檢測方法對比數(shù)據(jù)更加豐富，使用高內(nèi)涵儀器進行檢測可直觀細胞形態(tài)、細胞器狀態(tài)，對細胞的各項指標進行計算，分析數(shù)據(jù)快速，準確性高。非常適合高通量、多指標檢測，且活細胞實時檢測數(shù)據(jù)更接近在體狀態(tài)，可直觀反映實時細胞情況。也有研究使用其他凋亡檢測試劑盒，對細胞染色后進行高內(nèi)涵檢測，結(jié)果有效且可信度高[2]。

3.3 局限和展望 有研究表明高內(nèi)涵分析方法最適合于貼壁細胞的數(shù)據(jù)采集和篩選分析，尤其在高通量分析多樣本且細胞數(shù)較少時優(yōu)勢更為明顯，其可從細胞群體中的單個細胞的反應獲取大量信息，不僅僅是一個孔板中所有細胞的平均反應[3]?？梢栽诒３旨毎Y(jié)構(gòu)和功能完整的條件下，同時檢測細胞生長、分化、凋亡、代謝途徑等多個環(huán)節(jié)，涉及靶點廣泛。其分析貼壁細胞時，保留所有的形態(tài)特征和目的靶標，用較少的細胞得到更多的數(shù)據(jù)結(jié)果，提高通量的同時節(jié)約了時間和試劑，分析速度比樣品逐個處理快達數(shù)百倍[4]。高內(nèi)涵基于圖像的分析還可以對結(jié)果進行原始圖像的追述，如本研究中可見FITC綠色熒光標記的Annexin V，可顯示早期凋亡細胞，在獲取信息方面更加多樣化和可視化。但高內(nèi)涵分析方法也存在一定的局限性，儀器設備購置費用高昂，維修煩瑣，缺乏標準的細胞凋亡等數(shù)據(jù)的處理和分析方法，染料顏色不夠豐富以致較容易重疊，可能造成實驗研究中應用并不廣泛。隨著高內(nèi)涵技術(shù)的發(fā)展，或可開拓新技術(shù)，解決現(xiàn)有問題，提高利用率。

本研究為高內(nèi)涵技術(shù)檢測心肌細胞凋亡提供了方法和數(shù)據(jù)基礎，可為今后的細胞凋亡檢測提供參考。