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高血壓發(fā)病率與心血管疾病的發(fā)病率及死亡率呈正相關(guān)，而心血管疾病已成為全球首要死亡原因[1]。高血壓因其高發(fā)病率、高致殘率，難治療，成為科研人員關(guān)注的焦點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)高血壓導(dǎo)致的靶器官損害是導(dǎo)致病人器官功能衰竭、死亡的根本原因。因此，高血壓治療的重點(diǎn)不僅在于降壓，減輕其重要靶器官：心臟、腎臟、腦、血管的損害是治療的關(guān)鍵[2]。本研究觀察清達(dá)顆粒對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)血壓、心臟病形態(tài)及心功能的影響，評(píng)估該方控制血壓和改善靶器官損害的效果，并為進(jìn)一步研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)雄性SHR 12只，16周齡，體質(zhì)量(350±20)g；健康SPF級(jí)雄性Wistar大鼠6只，16周齡，體質(zhì)量(450±20)g，均由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。置SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室中正常喂養(yǎng)，恒溫、恒濕，每天光照12 h。

1.2 主要儀器和試劑 CODATM無創(chuàng)血壓儀(美國Kent)；Vevo?2100彩色多普勒超聲診斷儀購于美國FUJIFILM VisualSonics；HE染色劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；Masson染色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)有限公司)；QWin V3病理圖像分析系統(tǒng)(德國Leica公司)。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將12只SHR隨機(jī)分成模型組(SHR組)、清達(dá)顆粒組(SHR+QDG組)，6只Wistar作為空白組(Wistar組)。按照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》換算給藥劑量灌胃給藥，依照體表面積折算系數(shù)，人與大鼠的折算系數(shù)為0.018，計(jì)算清達(dá)顆粒給藥劑量為0.8 g/(kg·d)，給藥量1mL，空白組、模型組給予等量生理鹽水，干預(yù)8周。

1.3.2 測量血壓、體質(zhì)量 動(dòng)物先在福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行為期1周的適應(yīng)，在此期間對(duì)動(dòng)物進(jìn)行稱重，使用CODATM無創(chuàng)血壓儀，采用體積壓力傳感器技術(shù)(VPR)測量SHR大鼠尾動(dòng)脈的收縮壓(systolic blood pressure，SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)、平均壓(mean blood pressure，MBP)，并做好記錄。具體操作如下：①將一個(gè)閉塞套套在距離鼠尾根部大約1 cm的位置。②將容積壓力傳感器(VPR)套在鼠尾上，到達(dá)位置為傳感器無法再往鼠尾根部方向推動(dòng)為止；在閉塞套和VPR傳感器中充氣，直至閉塞套完全阻斷了鼠尾的血流，開始放氣，這時(shí)隨著放氣，鼠尾動(dòng)脈慢慢打開，至有血流從動(dòng)脈流入鼠尾，這時(shí)鼠尾的容積開始改變，容積壓力傳感器感受到鼠尾容積開始變大，鼠尾容積開始變化的這一點(diǎn)鼠尾的壓力便是收縮壓；繼續(xù)放氣，動(dòng)脈完全打開，靜脈也開始打開有回血流經(jīng)鼠尾。在靜脈打開的瞬間，容積壓力傳感器感應(yīng)到的鼠尾容積變化的斜率最大，鼠尾容積變化斜率最大時(shí)刻鼠尾壓便為舒張壓。③設(shè)置電腦軟件，每次15個(gè)循環(huán)，共測3次，可獲取相應(yīng)數(shù)值，然后從中挑選至少3次連續(xù)血壓值相近數(shù)值，最后取其平均值。

1.3.3 超聲心動(dòng)圖檢查 給藥結(jié)束后進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查。異氟烷持續(xù)吸入麻醉，將大鼠固定在超聲檢測臺(tái)上，用脫毛膏輕輕去除胸部毛發(fā)。用彩色多普勒超聲診斷儀檢測左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic dimension，LVIDd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic dimension，LVIDs)、舒張末期室間隔厚度(IVSd)、收縮末期室間隔厚度(IVSs)、舒張末左心室后壁厚度(LVPWd)、收縮末左心室后壁厚度(LVPWs)，并計(jì)算左室重量(LVM)、射血分?jǐn)?shù)(EF)和心肌縮短分?jǐn)?shù)(FS)。

1.3.4 HE染色 清達(dá)顆粒干預(yù)8周后，大鼠注射2%戊巴比妥鈉液麻醉后，將心臟完整取出，用生理鹽水沖洗干凈殘余的血液，在冰塊上仔細(xì)去除大血管及心包組織，沿室間隔去除心房，只保留心室，再剪去心尖，暴露出左右心室，心室置于4%多聚甲醛內(nèi)進(jìn)行固定。次日棄原固定用的4%多聚甲醛，于持續(xù)緩慢的流動(dòng)水下沖洗3～4 h后進(jìn)行酒精梯度脫水，二甲苯透明組織，石蠟浸蠟包埋；整修包埋的組織蠟塊，于切片機(jī)中進(jìn)行切片，切片厚度約4 μm，將切片鋪于40 ℃恒溫水中展片，充分展片后平貼于載玻片上，于37 ℃烘片機(jī)上過夜干燥。將烘干后的石蠟切片用二甲苯脫蠟，經(jīng)梯度乙醇脫蠟至水：二甲苯Ⅰ10 min，二甲苯Ⅱ10 min，無水乙醇Ⅰ15 min，無水乙醇Ⅱ 5 min，依次95%、90%、80%、70%乙醇各5 min，超純水沖洗3 min，沖洗2次，然后行HE染色。心臟在蘇木素染液中染色3 min，1%鹽酸酒精溶液分化3 s，流動(dòng)的自來水沖洗10 min，0.5%水溶性伊紅溶液中染色80 s。最后切片常規(guī)風(fēng)干，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察心臟心肌形態(tài)學(xué)變化。

1.3.5 Masson染色 將烘干后的石蠟切片用二甲苯脫蠟，經(jīng)梯度乙醇脫蠟至水：二甲苯Ⅰ10 min，二甲苯Ⅱ10 min，無水乙醇Ⅰ15 min，無水乙醇Ⅱ 5 min，依次95%、90%、80%、70%乙醇各5 min，超純水沖洗3 min，沖洗2次，然后行Masson染色。Weigert氏鐵蘇木素染色5 min，用鹽酸酒精分化，流水沖洗3次，返藍(lán)液返藍(lán)3 min，麗春紅染色5 min，蒸餾水洗3次，弱酸分化1 min，磷鉬酸分化3 min，弱酸分化1 min，直接苯胺藍(lán)染色3 min，弱酸分化1 min，蒸餾水洗3次，常規(guī)風(fēng)干，中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，同時(shí)比較選取視野范圍區(qū)域內(nèi)左室心肌組織細(xì)胞間質(zhì)、壁內(nèi)小動(dòng)脈周圍膠原纖維變化，并計(jì)算膠原蛋白容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)及心肌小動(dòng)脈血管周圍膠原面積與管腔面積比值(perivascular circumferential area，PVCA)。

2 結(jié) 果

2.1 清達(dá)顆粒對(duì)SHR血壓的影響 給藥前，SHR組收縮壓、舒張壓及平均壓與Wistar組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SHR組與SHR+QDG組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第4周后，SHR+QDG組收縮壓、舒張壓及平均壓較SHR組顯著下降(P<0.05)，提示清達(dá)顆?？梢杂行б种芐HR血壓升高。詳見圖1。

與Wistar組比較，*P<0.05；與SHR組比較，#P<0.05

2.2 清達(dá)顆粒對(duì)SHR LVID、IVS、LVPW、左心室重量及功能的影響 SHR組IVSd、IVSs與Wistar組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，SHR+QDG組IVSd、IVSs與SHR組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與Wistar組比較，SHR組LVIDd、LVIDs顯著縮小(P<0.05)，但SHR+QDG組與SHR組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與Wistar組比較，SHR組LVPWd及LVPWs顯著增厚(P<0.05)，SHR+QDG組LVPWd及LVPWs明顯低于SHR組(P<0.05)；與Wistar組比較，SHR組LVM顯著增大(P<0.05)，SHR+QDG組LVM較SHR組顯著下降(P<0.05)；各組間EF和心肌FS比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示清達(dá)顆?？梢杂行Ц纳聘哐獕涸斐傻男呐K重塑，對(duì)SHR心臟具有保護(hù)作用。詳見圖2。

與Wistar組比較，*P<0.05；與SHR組比較，#P<0.05

2.3 清達(dá)顆粒對(duì)SHR心臟病理形態(tài)的影響

2.3.1 HE染色顯示 Wistar組心肌細(xì)胞排列整齊，橫紋結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核大小均一，胞漿染色均勻，心肌細(xì)胞無變性、壞死。與Wistar組比較，SHR組大鼠心肌細(xì)胞明顯增大，部分心肌細(xì)胞腫脹變性，排列紊亂、斷裂，胞核濃縮深染、胞漿染色加深，橫紋結(jié)構(gòu)不清，并見炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象。清達(dá)顆粒組大鼠心肌病理性改變有所改善。詳見圖3。

2.3.2 心肌Masson染色顯示 心肌膠原纖維呈藍(lán)色，心肌肌纖維呈紅色。Wistar組大鼠結(jié)構(gòu)正常，心肌肌束間可見少量膠原蛋白染色。SHR組大鼠可見心肌間質(zhì)大量深染的膠原蛋白沉積，CVF顯著高于Wistar組(P<0.05)。SHR+QDG組大鼠心肌組織膠原蛋白沉積明顯減輕，CVF顯著低于SHR組(P<0.05)。詳見圖4。

2.3.3 心肌壁內(nèi)小動(dòng)脈Masson染色顯示 Wistar組大鼠心肌壁內(nèi)小動(dòng)脈周圍可見少量膠原蛋白染色。SHR組大鼠壁內(nèi)小動(dòng)脈管壁增厚，中膜周圍及中膜內(nèi)可見大量膠原蛋白沉積，PVCA顯著高于Wistar組(P<0.05)。SHR+QDG組大鼠壁內(nèi)小動(dòng)脈周圍膠原蛋白沉積明顯減輕，PVCA顯著低于SHR組(P<0.05)。詳見圖4。

圖3 清達(dá)顆粒對(duì)SHR心肌病理形態(tài)改變的影響(HE染色，400倍)

與Wistar組比較，*P<0.05；與SHR組比較，#P<0.05

3 討 論

高血壓是臨床上的常見病、多發(fā)病，并且發(fā)病率隨著年齡的增長呈上升趨勢(shì)。2014年調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國高血壓患病率高達(dá)29.6%，知曉率、治療率和控制率分別為42.6%、34.1%和9.3%。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，在我國由于高血壓引起的各種疾病中，心臟及腦血管病分別位于40 歲以上人群死亡原因的第1位和第3位。因此合理有效的降壓措施對(duì)于降低高血壓相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，高血壓發(fā)病的早期以肝陽上亢證居多，熱灼陰傷，則出現(xiàn)肝腎陰虛、肝陽上亢的癥狀。陽亢經(jīng)久不愈，腎陰虧耗，發(fā)展為陰虛。陰陽互消互長，陰虛則導(dǎo)致腎陽虛衰，而成陰陽兩虛之證候，最終多以卒中為結(jié)局[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)大多認(rèn)為高血壓以肝腎陰虛，痰濁阻滯為中心病理環(huán)節(jié)，大致分為肝陽上亢型、陰虛陽亢型、腎精不足、陰陽兩虛型、痰濕內(nèi)蘊(yùn)、瘀血阻竅、沖任失調(diào)型等7種類型。老年高血壓病根據(jù)其臨床表現(xiàn)，則可分為中氣不足、腎陰虛、命門火衰、肝陽上亢、心脾兩虛、痰濕中阻、氣滯血瘀7種類型[4]。

左室肥厚是高血壓心臟病最典型變化，是高血壓引起心室重構(gòu)的結(jié)果，主要包括功能重構(gòu)、電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)3方面。早期以向心性肥厚為標(biāo)志性特征改變。高血壓左室肥厚形成機(jī)制十分復(fù)雜，涉及遺傳、環(huán)境、細(xì)胞內(nèi)外各種刺激因子。血流動(dòng)力學(xué)改變?cè)谧笫曳屎癜l(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[5-6]。高血壓病人心肌構(gòu)造組織的膠原蛋白增多，小動(dòng)脈構(gòu)造周圍的膠原面積與管腔面積比值會(huì)增大，心肌纖維化的程度就會(huì)增強(qiáng)，導(dǎo)致心室重構(gòu)，引發(fā)心肌梗死、心肌缺血等心臟病變。因此改善高血壓引起的左室重構(gòu)具有重要意義[7-8]。

清達(dá)顆粒是由清眩降壓湯精簡而來。清眩降壓湯是陳可冀院士60多年來治療高血壓的經(jīng)驗(yàn)方劑，可以明顯抑制血壓升高，改善高血壓造成的心、腦、腎等重要靶器官的損傷[9-13]。清達(dá)顆粒是由天麻12 g、鉤藤10 g、黃芩6 g、蓮子心5 g組成，主要治療高血壓病肝腎陰虛或陰虛上亢證病人。君藥天麻平肝潛陽，輔以鉤藤，助天麻清熱平肝熄風(fēng)，黃芩清肝熱，蓮子心泄心火，從而使肝之浮陽潛藏，心肝火熱得降，達(dá)到潛肝平陽，抑制動(dòng)風(fēng)之功效，符合中醫(yī)藥治療肝陽上亢高血壓的治則。

本研究發(fā)現(xiàn)，SHR組大鼠血壓較Wistar組血壓升高，并出現(xiàn)左心室肥厚及高血壓的心臟病理改變，而與SHR組比較，SHR+QDG組大鼠血壓逐漸下降，左心室肥厚和心肌間質(zhì)纖維化程度也得到改善。同時(shí)，對(duì)比心臟超聲結(jié)果顯示，SHR組大鼠左心室內(nèi)徑顯著縮小，左心室后壁厚度則顯著增厚，呈現(xiàn)典型向心性心肌肥厚的特點(diǎn)，而SHR+QDG組大鼠左心室內(nèi)徑未見顯著改善，左心室后壁厚度則顯著變薄，高血壓引起的心臟向心性肥厚癥狀則有所改善，且超聲結(jié)果與心臟HE、Masson染色結(jié)果相符。因此，清達(dá)顆粒改善心臟重構(gòu)的機(jī)制可能與降低壓力負(fù)荷有關(guān)。

綜上所述，清達(dá)顆粒能夠抑制心肌細(xì)胞重塑，逆轉(zhuǎn)心肌肥厚，降壓的同時(shí)具有明顯的靶器官保護(hù)作用。其作用機(jī)制可能是降低壓力負(fù)荷，減少機(jī)械牽張刺激。但其藥理作用是否還涉及其他作用靶點(diǎn)和通路還需進(jìn)一步研究。深入研究清達(dá)顆粒的作用機(jī)制，對(duì)于開展靶向藥物治療及指導(dǎo)臨床用藥具有深遠(yuǎn)的意義。