王寶娟 崔利鋒 李冬霞 張云虹 楊偉鋒 馬國安

（1.河北省衡水市第二人民醫(yī)院，河北 衡水 053000；2.河北省衡水市哈勵遜國際和平醫(yī)院，河北 衡水 053000）

急性肺損傷（ALI）是由各種肺內(nèi)外致病因素引起的以肺內(nèi)大量炎癥細胞浸潤和滲出、肺泡上皮及毛細血管內(nèi)皮屏障發(fā)生急性炎癥損傷，肺泡、肺間質(zhì)水腫等為主要特征的肺部炎性綜合反映，臨床上主要表現(xiàn)為急性進行性血氧過低的呼吸窘迫癥、非心源性肺水腫等，最終導(dǎo)致呼吸衰竭，其臨床病死率高達30%～50%［1-2］，是呼吸系統(tǒng)的危急重癥之一，嚴重威脅到人類的生命健康。細菌內(nèi)毒素是臨床上造成ALI的主要病因之一，其中又以革蘭陰性細菌內(nèi)毒素為主導(dǎo)，而其內(nèi)毒素的主要活性成分為脂多糖（LPS）。氣管內(nèi)滴入LPS與呼吸道細菌感染的過程相似，LPS進入肺內(nèi)后能夠引起肺內(nèi)炎癥細胞增多、肺微血管通透性增高等病理改變［3］，從而造成肺部的嚴重炎性反應(yīng)及炎性損傷，進而影響肺部結(jié)構(gòu)功能改變，最終導(dǎo)致ALI的發(fā)生［4］。

苓甘五味姜辛湯源于《金匱要略》，全方由茯苓、甘草、五味子、干姜、細辛組成。方中干姜為君，既能溫肺散寒以化飲，又能溫運脾陽以化濕；細辛溫肺散寒，助干姜治其已聚之痰；茯苓健脾滲濕利水，既能杜其生痰之源，又能導(dǎo)水飲之邪從小便而去，二者共為臣藥，從源流配合消除痰濕，以復(fù)肺之宣降之用；五味子斂肺氣以平咳喘，與細辛配伍，一收一散，共奏斂不留邪、散不傷正之功，且能調(diào)節(jié)肺司開合之職；甘草調(diào)和諸藥。全方共奏具有溫肺化飲之功效，常用于寒飲內(nèi)停之咳喘。目前臨床多用于治療咳嗽、慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘等肺系疾?。?-8］。本研究擬觀察苓甘五味姜辛湯對LPS致ALI大鼠動脈血T淋巴細胞亞群和支氣管肺泡灌洗液 （BALF）中白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-8（IL-8）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的影響，并探討其對ALI的可能作用及其機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取健康清潔級的2月齡SD大鼠90 只，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20） g，由中國食品藥品檢定研究院提供，合格證號：SCXK（京）2012-0068。飼養(yǎng)條件：無特殊病原菌（SPF）級環(huán)境，恒溫22～25℃，恒濕50%～65%。

1.2 試藥與儀器 苓甘五味姜辛湯方藥組成：茯苓12 g，甘草 9 g，五味子 5 g，干姜 9 g，細辛 5 g，桂枝 9 g。將藥材加4倍量水煎煮60 min，紗布過濾后將濾液另器置放，濾渣再加入3倍量水煎煮30 min后過濾，2次煎煮液混合后水浴濃縮至原藥材含量為0.8 g/mL，4℃放置備用，臨用時用蒸餾水稀釋。地塞米松注射液（批號130257，天津天藥藥業(yè)股份有限公司）；LPS（批號20161019，Sigma公司，德國）；FITC標記的抗大鼠CD3單克隆抗體、PE標記的抗大鼠CD4和CD8單克隆抗體（美國 Caltag公司）；IL-1β、IL-6、IL-8 和 TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（法國Diaclone公司）。主要儀器設(shè)備：大鼠固定操作臺 （PENN-CENTURY公司，美國）；3K15 型低溫高速離心機（Sigma公司，德國）；CO2培養(yǎng)箱（Yamato公司，日本）；光學(xué)顯微鏡（Olympus公司，日本）；DYZ-22A型雙恒定時電泳儀（北京市六一儀器廠）；DYY-Ⅲ橋式電泳槽 （北京市六一儀器廠）；BD-LSR型流式細胞儀 （Becton Dichinson公司，美國）；2016型切片機（上海萊卡儀器有限公司）。

1.3 動物分組 90只大鼠實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法分成6組，每組15只，分別為空白對照組、ALI模型組、地塞米松組和苓甘五味姜辛湯高、中、低劑量組（以下簡稱中藥高、中、低劑量組）。

1.4 造模與給藥 1）動物造模。采用LPS暴露式氣管滴注方法制備大鼠ALI模型［10］：末次給藥24 h后，除空白對照組外的5組大鼠用10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)板上，頸部消毒，縱向切開頸部皮膚，剝離皮下組織，暴露氣管，用2 mL注射器從氣管兩氣管環(huán)間快速刺入，在大鼠直立位下滴入脂多糖溶液10 mg/kg，輕度晃動數(shù)次以使液體能夠均勻分布于肺內(nèi)后縫合切口以制作ALI模型。大鼠自然清醒后自由活動，禁食，未禁水。2）干預(yù)方法。大鼠給藥劑量按人與大鼠之間體表面積折算［9］等效劑量為4 g/kg，高劑量為2倍等效劑量，低劑量為1/2倍等效劑量，按上述給藥量，用蒸餾水將苓甘五味姜辛湯煎煮液配置成中藥高、中、低劑量濃度分別為0.8、0.4、0.2 g/mL?？瞻讓φ战M和模型組給予等劑量的0.9%氯化鈉注射液灌胃，地塞米松組取地塞米松注射液1.0 mg/kg腹腔注射，每日1次，連續(xù)用藥27 d。

1.5 標本采集與檢測 1）實驗取材：10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)舌靜脈注入肝素抗凝，收集大鼠腹主動脈血保存待用；處死大鼠后將其仰臥位固定，使用無菌剪刀剪開大鼠頸部和胸部的皮膚組織，暴露胸腔，將大鼠右主支氣管結(jié)扎后，用注射器在主氣管上向肺部注入磷酸鹽緩沖液2 mL進行左肺灌洗，重復(fù)3次后留取支氣管肺泡灌洗液（BALF）備用。2）肺組織病理學(xué)檢測及病理學(xué)評分：取大鼠右肺中葉組織，用10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋后切片（片厚5 μm），取切片進行蘇木精-伊紅（HE）染色；光鏡下觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)改變，并進行病理學(xué)評分［11］。 3）肺濕/干質(zhì)量比測定：取大鼠右肺下葉組織，先除去表面脂肪組織，再用濾紙吸干組織表面的液體后稱量肺組織的濕質(zhì)量；將肺組織置于70℃烘箱48 h至恒重后再次稱量其干質(zhì)量，并計算肺組織濕/干質(zhì)量比（W/D）值，用來評估肺組織水腫程度。4）大鼠動脈血中CD3+、CD4+和CD8+的測定［12］：按照試劑盒說明書的步驟，采用流式細胞技術(shù)對大鼠腹主動脈血中T淋巴細胞亞群進行測定［1］。5）大鼠 BALF 中 IL-1β、IL-6、IL-8 和 TNF-α水平的測定［13］：按試劑盒說明書方法，采用ELISA法測定 IL-1β、IL-6、IL-8和 TNF-α 因子的濃度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，組間比較用單因素方差分析，兩組間比較用q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肺組織病理形態(tài)改變及病理學(xué)評分見圖1，表1。顯微鏡下觀察見空白對照組大鼠肺組織形態(tài)、肺泡結(jié)構(gòu)正常，肺泡壁薄，間隔無水腫，無明顯炎癥改變。ALI模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)破壞，部分肺泡塌陷，肺泡水腫明顯，肺泡間隔明顯增厚，肺泡壁有大量中性粒細胞浸潤及滲出物，肺泡腔內(nèi)炎癥細胞浸潤，肺間質(zhì)彌漫性充血水腫。地塞米松組及中藥高劑量、中劑量組的肺組織上述變化較模型組明顯減輕，炎癥細胞浸潤數(shù)量減少，充血、水腫程度減輕，且肺組織結(jié)構(gòu)明顯改善。中藥低劑量組肺組織結(jié)構(gòu)改善不明顯，肺泡腔內(nèi)仍有大量炎癥細胞浸潤，肺間質(zhì)部分充血水腫。病理學(xué)評分方面，ALI模型組評分明顯高于空白對照組（P＜0.05），經(jīng)不同藥物干預(yù)后，地塞米松組和中藥高、中劑量組評分均明顯降低（P＜0.05），中藥低劑量組評分降低不明顯（P＞0.05），中藥各組與地塞米松組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠肺組織病理形態(tài)改變（HE染色，200倍）

表1 各組大鼠病理學(xué)評分及W/D比值比較（x±s）

2.2 各組大鼠肺組織W/D比值情況比較 見表1。與空白對照組相比，ALI模型組肺組織水腫明顯，W/D比值明顯增加，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。地塞米松組與中藥高劑量組、中劑量組肺組織水腫現(xiàn)象較ALI模型組明顯減輕，W/D比值降低，有顯著差異（P＜0.05）。中藥低劑量組肺組織W/D比值較ALI模型組降低不明顯（P＞0.05）。

2.3 各組大鼠動脈血 CD3+、CD4+、CD8+和 CD4+/CD8+水平比較 見表2。ALI模型組動脈血中CD3+、CD4+、和CD4+/CD8+水平較空白對照組明顯降低（P＜0.05），CD8+水平明顯升高（P＜0.05）。 與 ALI模型組比較，中藥高劑量組、中劑量組動脈血中CD3+、CD4+和CD4+/CD8+水平明顯升高（P＜0.05），CD8+水平明顯降低（P＜0.05）；地塞米松組和中藥低劑量組與ALI模型組相比各項指標變化不明顯（P＞0.05）。

表2 各組大鼠CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+水平比較（%，x±s）

2.4 各組大鼠 BALF中 IL-1β、IL-6、IL-8和 TNF-α水平比較 見表3。LPS造模后大鼠BALF中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α水平均升高，與空白對照組比較差異顯著（P＜0.05）；經(jīng)高、中劑量的中藥處理可顯著降低各項指標的水平，與地塞米松組效果相當，與ALI模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組大鼠 IL-1β、IL-6、IL-8 和 TNF-α 水平比較（x±s）

3 討 論

近年來，采用氣管內(nèi)滴入LPS的方式制作ALI動物模型的方法已經(jīng)廣泛運用于ALI發(fā)病機理和藥物防治的研究［14］。因為LPS不僅能損傷肺臟，還能激活多種炎癥細胞，使其釋放大量炎癥介質(zhì)或細胞因子，進而導(dǎo)致肺組織損傷［15］。本研究中大鼠氣管內(nèi)滴注LPS后，出現(xiàn)大鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞、肺泡炎癥細胞浸潤等典型的ALI病理改變，提示本研究成功建立了ALI的動物模型。同時ALI模型大鼠肺組織病理學(xué)評分以及W/D比值升高，表明LPS氣管內(nèi)滴藥能引起明顯的大鼠肺組織損傷。而苓甘五味姜辛湯干預(yù)后能明顯減輕損傷，降低肺組織病理學(xué)評分和W/D比值，提示苓甘五味姜辛湯對ALI大鼠的肺臟有明顯的保護作用。

T淋巴細胞亞群是細胞免疫的主要組成部分，其中，CD3+是鑒定 T 細胞的重要標記［16］；CD4+能誘導(dǎo)和輔助細胞毒T細胞前身成為細胞毒T細胞，輔助其他免疫細胞功能的發(fā)揮，其數(shù)量的減少代表機體免疫功能的降低［17］；CD8+主要分布在抑制性和殺傷性T淋巴細胞表面，通過自身和抑制因子在免疫反應(yīng)中起負向調(diào)節(jié)作用，若其細胞數(shù)量過多反而會對機體造成損傷；CD4+/CD8+則能反映機體免疫功能是否紊亂，并且其下降程度與疾病的嚴重程度、預(yù)后均密切相關(guān)［18］。本研究結(jié)果顯示，ALI大鼠動脈血中CD3+、CD4+和CD4+/CD8+值降低，CD8+升高，提示LPS造模后能引起T淋巴細胞亞群的表達異常，從而導(dǎo)致ALI和免疫抑制。而經(jīng)高、中劑量苓甘五味姜辛湯干預(yù)后，以上指標均有所恢復(fù)，表明苓甘五味姜辛湯能提高機體免疫力，糾正機體細胞免疫抑制狀態(tài)。

ALI的主要特點是炎癥介質(zhì)大量合成和釋放，IL-1β，IL-6、IL-8以及TNF-α等促炎介質(zhì)的水平，可反映肺組織炎癥反應(yīng)的強度［19］。IL-1β是急性炎癥反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)物質(zhì)，并且能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-6和IL-8等［20］。IL-6是強有力的促炎因子，主要參與肺損傷時肺內(nèi)炎癥的過度反應(yīng)，其不僅能對組織直接造成傷害，還能增強組織細胞對TNF-α的敏感性［21］。IL-8是中性粒細胞最有效和最主要的趨化因子，能促使中性粒細胞活化和遷移，釋放出大量的損傷介質(zhì)引起肺損傷［22］。TNF-α是ALI最重要的啟動因子，能趨化炎癥細胞在肺內(nèi)聚集、黏附，從而損傷肺血管內(nèi)皮細胞［23］。TNF-α還能使炎癥細胞釋放IL-1β、IL-6和IL-8等二級炎癥因子，加重肺組織炎癥損傷［24］。本實驗結(jié)果表明，LPS造模后大鼠 BALF 中 IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 水平顯著升高，其原因可能是因為ALI后導(dǎo)致肺泡毛細血管屏障下降，白細胞向肺泡內(nèi)遷移，被激活的細胞進而產(chǎn)生 IL-1β、IL-6、IL-8等多種炎性遞質(zhì)以及 TNF-α等前炎性遞質(zhì)；而經(jīng)苓甘五味姜辛湯干預(yù)后可顯著降低其水平，表明苓甘五味姜辛湯可以抑制IL-1β、IL-6、IL-8以及TNF-α等炎性因子的合成和釋放，從而減輕肺組織的炎性損傷程度。

綜上所述，苓甘五味姜辛湯能減輕肺損傷，改善肺水腫，提高機體免疫力，糾正機體細胞免疫抑制狀態(tài)，抑制 IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 的合成和釋放，為臨床救治ALI提供了新思路。