朱 波 楊 艷 蘇仁意 許細(xì)平 孫乾朕

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院，湖北 襄陽(yáng) 441000）

缺氧缺血性腦損傷（HIBD）是造成新生兒多種神經(jīng)功能障礙的疾病之一，嚴(yán)重威脅新生兒生命健康［1］。據(jù)調(diào)查，圍生期HIBD新生兒死亡率高達(dá)20%，經(jīng)治療幸存患兒中約40%存在腦神經(jīng)損害等后遺癥［2］。目前，HIBD主要依靠亞低溫療法進(jìn)行治療，但其預(yù)后效果并不理想。相關(guān)研究指出，病理性神經(jīng)元自噬是造成多種神經(jīng)元損傷凋亡的重要原因之一［3］。因此，尋找調(diào)節(jié)神經(jīng)元自噬藥物的研究是目前治療HIBD的新思路。丹參酮ⅡA是丹參主要有效成分之一，難溶于水，易溶于有機(jī)溶劑。丹參酮ⅡA因含有醌型結(jié)構(gòu)，具有多種藥理藥效，例如改善冠狀動(dòng)脈循環(huán)、修復(fù)心肌損傷、抗細(xì)胞凋亡、神經(jīng)保護(hù)等［4］。相關(guān)研究顯示，丹參酮ⅡA對(duì)多種臟器的缺氧缺血性損傷具有保護(hù)作用［5-6］。任陳等研究發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA能明顯減輕放射線在體外對(duì)海馬神經(jīng)元細(xì)胞的放射損傷作用，并推測(cè)其保護(hù)機(jī)制可能與調(diào)節(jié)放療過(guò)程中神經(jīng)元自噬相關(guān)［7］。因此，本研究擬通過(guò)建造新生大鼠缺血缺氧性腦損傷模型，觀察丹參酮ⅡA對(duì)HIBD新生大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元自噬及Akt-mTOR通路影響并探討其機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)7日齡SD（Sprague-Dawley）大鼠80，雌雄不計(jì)，體質(zhì)量11.6～12.17 g，平均體質(zhì)量（11.98±0.32）g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SYXK（豫）2015-0003。

1.2 試劑與儀器 丹參酮ⅡA磺酸鈉購(gòu)自上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H31022558，批號(hào)160916。蛋白酶抑制劑購(gòu)自上海子起生物科技有限公司，貨號(hào)E429-10MG。RIPA裂解液購(gòu)自北京君諾德生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)7011A。BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司，貨號(hào)JK-201。LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-Akt、p-mTOR、p-S6、GADPH蛋白抗體及HRP綴合的二抗均購(gòu)自藥明康德。透射電子顯微鏡購(gòu)自尼康儀器（上海）有限公司。酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)伯騰儀器。

1.3 分組與造模 將SD幼鼠隨機(jī)分為5組，每組16只，分別為假手術(shù)組、模型組、高劑量組（0.1 mg/g）、中劑量組（0.05 mg/g）、低劑量組（0.02 mg/g）。假手術(shù)組僅左頸部切口處理，其余各組進(jìn)行造模。3%乙醚麻醉幼鼠，手術(shù)暴露左側(cè)頸主動(dòng)脈，分離神經(jīng)，結(jié)扎血管，縫合傷口。放回原飼養(yǎng)環(huán)境，恢復(fù)3 h后，將幼鼠置于常壓缺氧艙內(nèi)，溫度37℃，濕度45%～55%，持續(xù)通入8%O2和92%N2缺氧處理2.5 h，幼鼠出現(xiàn)左旋即為造模成功。

1.4 給藥方法 高劑量組、中劑量組、低劑量組幼鼠分別給予不同劑量的丹參酮ⅡA注射液，于出現(xiàn)左旋現(xiàn)象時(shí)腹腔注射1次，24 h后重復(fù)注射1次。假手術(shù)組與模型組分別按照上述給藥方式給予等體積0.9%氯化鈉注射液。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）大腦皮質(zhì)超微結(jié)構(gòu)觀察。缺氧缺血處理32 h后，取幼鼠斷頭取左腦，利用解剖鏡迅速剝離大腦皮質(zhì)，置于冰上盛有2.5%戊二醛容器中進(jìn)行處理，用1%鋨酸對(duì)腦組織進(jìn)行固定，乙醇和丙酮不同濃度由低至高進(jìn)行脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，切片，利用乙酸雙氧鈾和硝酸鉛染色，置于透射電子顯微鏡下觀察拍片。2）TTC染色觀察腦梗死面積。缺氧缺血處理36 h，取幼鼠斷頭，取左腦置于冰上。Rat Brain Matrix由前之后切片，厚度5 μm。室溫條件下，將切片置于2%TTC中，孵育35 min，PBS緩沖液洗滌，10%中性甲醛固定。數(shù)碼相機(jī)采集圖片，正常腦組織為紅色，梗死組織為白色。利用Image J對(duì)采集圖片急性分析，統(tǒng)計(jì)梗死面積百分比。3）蛋白免疫印跡法檢測(cè)腦組織自噬蛋白表達(dá)。缺氧缺血處理48 h，取幼鼠進(jìn)行斷頭取腦，取左側(cè)腦組織，例用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取腦組織蛋白。4℃下10 000×g離心8 min后取上清，BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)總蛋白，10%SDS-PAGE分離膠分離蛋白，半干法轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上。PBS配制的5%脫脂乳對(duì)膜進(jìn)行封閉，4℃過(guò)夜。棄封閉液，PBS緩沖液清洗膜5次，每次4 min。LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-Akt、p-mTOR、p-S6 蛋白抗體及內(nèi)參GADPH蛋白抗體作為一抗，室溫孵育3 h。棄溶液，PBS緩沖液洗滌5次，每次4 min。室溫條件下，HRP綴合的二抗孵育1.5 h。利用Image J軟件分析條帶灰度，評(píng)估蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，兩組間比較行t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組新生大鼠大腦皮質(zhì)超微結(jié)構(gòu) 見(jiàn)圖1，表1。假手術(shù)組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核、線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體及溶酶體均正常存在。模型組中觀察到皮質(zhì)神經(jīng)元中存在大量的自噬體和自噬溶酶體，其泡狀自噬體中包裹有可見(jiàn)的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)。相較于模型組，高劑量組、中劑量組、低劑量組中自噬體數(shù)量明顯減少，且呈一定的劑量依賴性（P＜0.05）。

圖1 各組新生大鼠大腦皮質(zhì)超微結(jié)構(gòu)（乙酸雙氧鈾和硝酸鉛染色，5000倍）

表1 各組新生大鼠大腦皮質(zhì)超微結(jié)構(gòu)（x±s）

圖2 各組新生大鼠腦梗死組織切片

2.2 各組新生大鼠腦梗死比較 與假手術(shù)組比較，模型組中幼鼠大腦皮質(zhì)、海馬等區(qū)域呈現(xiàn)明顯的大面積白色梗死。與模型組比較，高劑量組、中劑量組、低劑量組中幼鼠腦梗死程度均有所改善。見(jiàn)圖2。對(duì)各組中幼鼠腦梗死面積進(jìn)行定量，發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組比較，模型組中幼鼠腦梗死面積顯著增加 （P＜0.05）。與模型組比較，高劑量組、中劑量組、低劑量組腦梗死面積顯著減小，且呈一定的劑量依賴性（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組新生大鼠腦梗死情況比較（%，x±s）

2.3 各組新生大鼠腦組織自噬蛋白表達(dá)情況比較

見(jiàn)圖3，表3。與假手術(shù)組比較，模型組新生大鼠腦組織中 LC3-Ⅰ/（LC3-Ⅰ＋LC3-Ⅱ）的比值顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，高劑量組、中劑量組、低劑量組新生大鼠腦組織中LC3-Ⅰ/（LC3-Ⅰ＋LC3-Ⅱ）的比值顯著降低，呈劑量依賴性（P＜0.05）。模型組新生大鼠腦組織中Beclin-1蛋白表達(dá)水平與假手術(shù)組比較顯著上升（P＜0.05）。與模型組比較，高劑量組、中劑量組、低劑量組新生大鼠腦組織中Beclin-1蛋白表達(dá)水平顯著下降，且呈劑量依賴性（P＜0.05）。

圖3 各組新生大鼠腦組織自噬蛋白表達(dá)情況

表3 各組新生大鼠腦組織自噬蛋白表達(dá)情況比較（x±s）

2.4 各組新生大鼠腦組織中p-Akt表達(dá)情況比較

見(jiàn)圖4，表4。與假手術(shù)組比較，模型組新生大鼠腦組織中p-Akt蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，高劑量組、中劑量組、低劑量組新生大鼠腦組織中p-Akt蛋白的表達(dá)水平顯著升高，呈劑量依賴性（P＜0.05）。

圖4 各組新生大鼠腦組織中p-Akt表達(dá)情況

表4 各組新生大鼠腦組織中p-Akt表達(dá)情況比較（x±s）

2.5 各組新生大鼠腦組織中p-mTOR表達(dá)情況比較見(jiàn)圖5，表5。與假手術(shù)組比較，模型組新生大鼠腦組織中p-mTOR蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。相較于模型組，高劑量組、中劑量組、低劑量組新生大鼠腦組織中p-mTOR蛋白的表達(dá)水平呈顯著升高，且呈劑量依賴性（P＜0.05）。

圖5 各組新生大鼠腦組織中p-mTOR表達(dá)情況

表5 各組新生大鼠腦組織中p-mTOR表達(dá)情況比較（x±s）

2.6 各組新生大鼠腦組織中p-S6表達(dá)情況比較 見(jiàn)圖6，表6。相較于假手術(shù)組，模型組新生大鼠腦組織中p-S6蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。相較于模型組，高劑量組、中劑量組、低劑量組新生大鼠腦組織中p-S6蛋白的表達(dá)水平呈顯著升高，且呈劑量依賴性（P＜0.05）。

圖6 各組新生大鼠腦組織中p-S6表達(dá)情況

表6 各組新生大鼠腦組織中p-S6表達(dá)情況比較（x±s）

3 討 論

HIBD的發(fā)生機(jī)制極其復(fù)雜，與氧自由基、神經(jīng)元自噬、神經(jīng)元凋亡等密切相關(guān)［9］。相關(guān)研究指出，大腦發(fā)生缺氧缺血早期便可引起細(xì)胞凋亡及神經(jīng)元病理性自噬等［10］。本研究實(shí)驗(yàn)顯示，與假手術(shù)組比較，模型組中幼鼠大腦皮層、海馬等區(qū)域呈現(xiàn)明顯的大面積白色梗死，表明造模成功；高劑量組、中劑量組、低劑量組中腦梗死面積較模型組顯著減小，且呈一定的劑量依賴性，表明丹參酮ⅡA能有效改善腦梗死情況。

自噬是降解細(xì)胞內(nèi)蛋白和損傷細(xì)胞器，穩(wěn)定細(xì)胞環(huán)境的主要方式［11］。相關(guān)研究指出，當(dāng)自噬處于穩(wěn)態(tài)平衡時(shí)對(duì)機(jī)體具有保護(hù)作用，但當(dāng)自噬平衡狀態(tài)打破時(shí)，將導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)損傷［12］。 Lu 等［13］研究中發(fā)現(xiàn)，新生大鼠缺血缺氧性腦損傷模型中自噬體數(shù)量明顯增加，自噬標(biāo)志蛋白表達(dá)水平明顯上升，當(dāng)自噬抑制劑作用于模型可顯著降低自噬體數(shù)量，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，其認(rèn)為自噬的激活對(duì)新生大鼠HIBD具有促進(jìn)作用。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，LC3（微管相關(guān)蛋白輕鏈3）可作為自噬形成標(biāo)志物，當(dāng)細(xì)胞受到某種刺激，位于細(xì)胞內(nèi)的LC3-Ⅰ將脂質(zhì)化為L(zhǎng)C3-Ⅱ，參與形成自噬體，因此可根據(jù)分析LC3-Ⅱ/（LC3-Ⅰ+LC3-Ⅱ）的比值是否上調(diào)判斷自噬體的形成［14］。還有研究證實(shí)，Beclin-1為除 LC3外與自噬密切相關(guān)的蛋白，主要參與自噬過(guò)程啟動(dòng)［15］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組中觀察到皮質(zhì)神經(jīng)元中存在大量的自噬體和自噬溶酶體，其中泡狀自噬體中包裹有可見(jiàn)的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)，同時(shí)與模型組比較，高劑量組、中劑量組、低劑量組中自噬體數(shù)量明顯減少，且呈一定的劑量依賴性。同時(shí)本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，模型組中LC3-Ⅱ/（LC3-Ⅰ+LC3-Ⅱ）的比值和Beclin-1蛋白表達(dá)水平較假手術(shù)組均顯著降低，表明缺氧缺血破壞神經(jīng)元內(nèi)穩(wěn)定環(huán)境，造成蛋白錯(cuò)誤修飾及細(xì)胞器損傷，從而通過(guò)上調(diào)Beclin-1蛋白表達(dá)水平啟動(dòng)自噬，LC3-Ⅰ脂質(zhì)化，形成自噬體。與模型組比較，高劑量組、中劑量組、低劑量組新生大鼠腦組織中LC3-Ⅱ/（LC3-Ⅰ+LC3-Ⅱ）的比值和Beclin-1蛋白表達(dá)水平顯著下降，且呈劑量依賴性，提示丹參酮ⅡA可通過(guò)抑制LC3-Ⅱ/（LC3-Ⅰ+LC3-Ⅱ）的比值和Beclin-1蛋白表達(dá)水平，抑制自噬過(guò)程。

Akt-mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是哺乳動(dòng)物腫瘤免疫中的重要信號(hào)通路，其對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、自噬以及凋亡有重要的作用［16］。Akt被相關(guān)因子激活磷酸化，發(fā)生空間轉(zhuǎn)移，由胞漿轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，進(jìn)而調(diào)控下游如mTOR、Caspase-9、cyclin-D1等相應(yīng)的信號(hào)分子，其中mTOR發(fā)生磷酸化激活下游p70S6K，促進(jìn)核糖體蛋白S6發(fā)生磷酸化，從而調(diào)控細(xì)胞自噬，此調(diào)節(jié)過(guò)程與自噬的形成具有負(fù)相關(guān)性［17］。Makhov等通過(guò)蓽茇明堿對(duì)mTOR信號(hào)影響的研究中發(fā)現(xiàn)，蓽茇明堿能有效抑制細(xì)胞中Akt靶蛋白的磷酸化，下調(diào)Akt可有效抑制下游mTORC1的活性與細(xì)胞自噬［18］。本研究實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組新生大鼠腦組織中p-Akt、p-mTOR、p-S6蛋白的表達(dá)水平均顯著降低，提示Akt-mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元自噬，且呈負(fù)調(diào)節(jié)作用。與模型組比較，高劑量組、中劑量組、低劑量組新生大鼠腦組織中p-Akt、p-mTOR、p-S6蛋白表達(dá)水平均升高，并呈劑量依賴性，提示丹參酮ⅡA對(duì)Akt-mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有正調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，丹參酮ⅡA對(duì)新生大鼠缺血缺氧性腦損傷具有顯著的改善作用，大腦皮質(zhì)神經(jīng)元自噬受到顯著的抑制，推測(cè)其機(jī)制可能為通過(guò)激活A(yù)kt-mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制神經(jīng)元自噬，從而改善腦損傷情況。然而，缺血缺氧性腦損傷是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，其具體調(diào)節(jié)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。