唐 雷 徐派的 張紅星 康朝霞

（湖北中醫(yī)藥大學(xué)，武漢 湖北 430065）

功能性消化不良（FD）是指起源于胃或十二指腸的消化不良癥狀，表現(xiàn)為早飽感、餐后飽脹不適、上腹灼熱感或上腹疼痛，且器質(zhì)性和代謝性疾病無(wú)法解釋這些癥狀［1］。FD患病率為11.5%～29.2%，且在不斷上升，嚴(yán)重影響患者的生活及工作［2］。由于FD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，藥物治療存在副作用，且個(gè)體差異性明顯，近年來(lái)應(yīng)用電針治療FD的療效得到大量實(shí)驗(yàn)及臨床研究支持［3-5］。在以往研究中我們也發(fā)現(xiàn)，電針足三里穴可有效地促進(jìn)消化功能的恢復(fù)，并可恢復(fù)FD大鼠的血漿胃促生長(zhǎng)素（Ghrelin）水平［6］，但 Ghrelin 的調(diào)節(jié)機(jī)制還不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)大鼠胃黏膜中雷帕霉素靶蛋白（mTOR）與Ghrelin有共定位現(xiàn)象，可以調(diào)節(jié)食物攝取［7］。還有研究表明大鼠神經(jīng)、胃腸等組織中的腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）的表達(dá)與電針干預(yù)作用有關(guān)［8］。本研究旨在觀察電針足三里對(duì)FD大鼠AMPKα及mTOR的影響，初步探討電針治療FD的相關(guān)機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用8～12周齡無(wú)特定病原體（SPF）級(jí) SD 大鼠 50 只，體質(zhì)量（200±20） g，雌雄各 25 只，8～12周齡，購(gòu)買(mǎi)于湖北實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（鄂）2011-0012。將上述大鼠飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)SPF動(dòng)物房?jī)?nèi)，相對(duì)濕度50%～70%，室溫22℃。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與儀器 主要試劑包括RIPA蛋白裂解緩沖液、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、Western一抗、二抗稀釋液（均購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、AMPKα抗體（sc33524，SANTA 公司）、mTOR 抗體（Ab109268，Abcam 公司）、actin 內(nèi)參抗體（A20120A0702，BioTNT公司）、 羊抗兔 IgG （PAB150011，Bio-swamp公司）、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（639505，TAKAPA公司）等；主要實(shí)驗(yàn)儀器包括高速低溫離心機(jī)（X-22，美國(guó)Beckman公司）、全自動(dòng)檢測(cè)酶標(biāo)儀（168-1002XC，美國(guó)BIORAD 公司）、Western電泳儀 （Mini-Trans Blot， 美國(guó)BIO-RAD公司）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（CFX-96，美國(guó)BIO-RAD公司）、無(wú)菌針灸針（0.25 mm×10.0 mm，蘇州醫(yī)療用品有限公司）、韓氏電針儀（HANS-200A，南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司）等。

1.3 分組與造模 按隨機(jī)數(shù)字表法挑選10只大鼠納入正常組，余40只大鼠進(jìn)行造模，14 d后剔除造模未成功大鼠。采用隨機(jī)數(shù)字表法將造模成功大鼠分為模型組及電針組，每組10只。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核、許可。造模方法參考王煜姣等［9］的方法，采用不規(guī)則飲食配合夾尾刺激法，制模大鼠每逢周一、周三、周五禁止攝食、飲水，同時(shí)用長(zhǎng)海綿鉗夾大鼠尾巴末端1/3處，以不破皮但使其尖叫掙扎為度，讓大鼠之間相互廝打，每日 2 次（9∶00，16∶00），每次持續(xù)30 min，連續(xù)刺激14 d。大鼠出現(xiàn)飲水及飲食明顯減少，毛發(fā)變黃，枯燥無(wú)光澤，倦臥活動(dòng)減少，情緒低落抑郁，容易激惹，提示造模成功。

1.4 干預(yù)方法 采用自制鼠衣束縛電針組FD大鼠，并將其懸掛于自制裝置上，參照 《大鼠穴位圖譜的研制》［10］選取“足三里”穴，用 1寸針灸針針刺 FD 大鼠雙側(cè)“足三里”穴，針刺深度為0.3～0.5寸，進(jìn)針后接通HANS-200A電針儀；設(shè)置電針刺激參數(shù)如下：疏密波，頻率2 Hz/100 Hz，電刺激強(qiáng)度2 mA，每次 30 min，每日1次，共治療10 d。在電針組進(jìn)行電針刺激同時(shí)，正常組及模型組大鼠也進(jìn)行束縛固定（同電針組），但不給予針刺及電針干預(yù)。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 最后一次治療結(jié)束后大鼠禁食24 h，給予腹腔麻醉 （將7%水合氯醛配成0.5 mL/100 g劑量），然后將大鼠固定，剖開(kāi)腹腔后結(jié)扎胃賁門(mén)和胃幽門(mén)，剪開(kāi)胃體，清洗胃內(nèi)容物后拭干，剪取胃竇組織裝于EP管中，立即用液氮凍存，最后置于-80℃冰箱中保存待測(cè)。1）采用Western blotting法檢測(cè)大鼠胃竇AMPKα、mTOR蛋白表達(dá)。取100 mg胃竇加入1 mL裂解液勻漿，將裂解后的樣品在4℃、12 000 g條件下離心15 min，取上清進(jìn)行蛋白質(zhì)定量后貯存于-80℃冰箱中。根據(jù)待測(cè)蛋白的分子量配置SDSPAGE凝膠，然后電泳轉(zhuǎn)膜，封閉1 h孵育一抗4℃過(guò)夜，第2天孵育二抗后顯影。2）采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)大鼠胃竇AMPKα、mTOR mRNA表達(dá)。從-80℃冰箱中取100 mg胃竇，加入Trizol后研磨，多次離心后提取RNA，然后將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。其擴(kuò)增方法如下：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性5 s，56℃退火10 s，72℃延伸25 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；采用2-△△ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊時(shí)采用最小顯著差異法（LSD），方差不齊時(shí)采用 Dunntt′s T3法，不符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)比較采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況 造模過(guò)程中正常組大鼠各項(xiàng)活動(dòng)均正常，模型組大鼠從第7日開(kāi)始發(fā)現(xiàn)籠內(nèi)糞便稀拉，可聞到鼠籠內(nèi)有明顯穢臭，第10～14日發(fā)現(xiàn)部分大鼠進(jìn)食、打斗明顯減少，毛發(fā)暗黃、不柔順、無(wú)光澤，情緒低落萎靡，提示FD大鼠造模成功。與模型組比較，電針組大鼠經(jīng)電針刺激后，發(fā)現(xiàn)大鼠活動(dòng)增多，進(jìn)食增加，毛發(fā)逐漸恢復(fù)光澤、柔順。

2.2 各組大鼠胃竇組織中AMPKα和mTOR mRNA的表達(dá)比較 見(jiàn)表1，圖1。與正常組大鼠比較，模型組FD大鼠胃竇中AMPKα mRNA的表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），mTOR mRNA 的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組FD大鼠比較，電針組FD大鼠胃竇中AMPKα mRNA的表達(dá)水平明顯升高 （P＜0.05），mTOR mRNA的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠胃竇中AMPKα和mTOR mRNA的表達(dá)量比較（x±s）

圖1 各組大鼠胃竇中AMPKα和mTOR mRNA的表達(dá)量

2.3 各組大鼠胃竇中AMPKα和mTOR蛋白的表達(dá)比較 見(jiàn)表2，圖2。與正常組大鼠比較，模型組FD大鼠胃竇中AMPKα蛋白的表達(dá)量顯著降低 （P＜0.05），mTOR蛋白的表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）；與模型組FD大鼠比較，電針組FD大鼠胃竇中AMPKα蛋白的表達(dá)量明顯升高 （P＜0.05），mTOR蛋白的表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠AMPKα和mTOR蛋白的表達(dá)量比較（x±s）

圖2 各組大鼠胃竇中AMPKα和mTOR蛋白的表達(dá)量

3 討 論

本研究結(jié)果提示，與正常組大鼠比較，模型組FD大鼠毛發(fā)暗黃、不柔順、無(wú)光澤，進(jìn)食、打斗均減少，狀態(tài)低落萎靡；胃竇組織中AMPKα mRNA以及蛋白表達(dá)水平顯著降低，mTOR mRNA以及蛋白表達(dá)水平顯著升高。與模型組比較，電針組FD大鼠毛發(fā)逐漸恢復(fù)光澤、柔順，活動(dòng)及進(jìn)食量均增加，胃竇組織中AMPKα mRNA以及蛋白水平明顯升高，mTOR mRNA以及蛋白表達(dá)水平明顯降低。

與同類研究比較［11-12］，雖然最終結(jié)果均提示電針能調(diào)節(jié)FD大鼠胃運(yùn)動(dòng)功能，但作用機(jī)制還是有所區(qū)別。王柳等認(rèn)為電針可能是通過(guò)改變大鼠迷走神經(jīng)背核（DMV）區(qū) N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDAR）活性從而調(diào)節(jié)血清NO含量并發(fā)揮治療作用［11］。楊云等認(rèn)為電針足三里改善胃腸功能的作用機(jī)制可能為降低FD 大鼠胃竇及血漿中神經(jīng)降壓素（NT）的表達(dá)［12］。

Ghrelin是一種重要的胃腸激素，具有控制食欲、增強(qiáng)胃動(dòng)力等作用，與機(jī)體胃腸功能具有高度相關(guān)性，在胃腸動(dòng)力學(xué)中的調(diào)節(jié)機(jī)制一直是研究熱點(diǎn)。mTOR作為一種高度保守的蘇氨酸/絲氨酸蛋白激酶，是Ghrelin的調(diào)節(jié)因子之一，分子大小為259 kDa，可以感知能量穩(wěn)態(tài)的變化，研究發(fā)現(xiàn)多種蛋白的合成、增殖、自噬等過(guò)程與它有關(guān)，多種細(xì)胞的生長(zhǎng)及細(xì)胞周期進(jìn)程也與它密不可分［13］。研究還表明胃竇組織中mTOR的變化也會(huì)導(dǎo)致Ghrelin表達(dá)量的改變，從而影響食物攝取［14］。

AMPK蛋白以異源三聚體復(fù)合物的形式存在，分別由不同的基因表達(dá)兩種亞型：α-亞基和β-亞基。AMPKα作為mTOR的上游調(diào)節(jié)分子之一，是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)能量代謝的重要調(diào)節(jié)因子，廣泛存在于骨骼肌、胃腸、胰腺等組織系統(tǒng)中，能夠精確地反映細(xì)胞能量狀態(tài)的變化［15-16］。研究發(fā)現(xiàn)，電針作為治療手段，能有效地增加相關(guān)疾病模型大鼠的骨骼肌、胃腸、神經(jīng)等組織中AMPKα的表達(dá)［17-18］。還有研究表明活化的AMPKα可以直接磷酸化結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合物（TSC），促進(jìn)TSC1/2復(fù)合物形成，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制mTOR的活性［19］。結(jié)合上述分析及本課題研究結(jié)果，在電針足三里治療功能性消化不良的過(guò)程中，可能存在基于AMPKα變化而調(diào)節(jié)mTOR的機(jī)制。

FD屬于中醫(yī)學(xué)的“胃脘痛”范疇，病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，脾虛為本，氣滯、食積、痰濕、血瘀為標(biāo)。脾為氣機(jī)之樞，主運(yùn)化，主升，胃主受納，主降，脾升胃降才能維持消化道正常運(yùn)化、受納、腐熟的功能。足三里穴是足陽(yáng)明胃經(jīng)合穴，又為胃的下合穴，能補(bǔ)脾胃，調(diào)腸腑，為后天生化之源?！端目傃ǜ琛吩啤岸歉谷锪簟薄！鹅`樞·邪氣臟腑病形》曰“合治內(nèi)腑”?！端貑?wèn)·水熱穴論》云“氣街、三里、巨虛上下廉，此八者以瀉胃中之熱也”。這些都充分說(shuō)明了足三里穴善治脾胃病的特點(diǎn)，是胃腸疾病中最常見(jiàn)的取穴。電針是通過(guò)各種物理化學(xué)方式刺激相關(guān)腧穴，從而激發(fā)經(jīng)絡(luò)之氣，促進(jìn)陰陽(yáng)協(xié)調(diào)，達(dá)到防治疾病的目的［20］。這也是采用電針足三里穴治療功能性消化不良的原因。

綜合本研究結(jié)果來(lái)看，電針足三里穴可改善FD大鼠的胃腸消化，增加FD大鼠胃竇AMPKαmRNA以及蛋白的表達(dá)水平、降低FD大鼠胃竇mTOR mRNA以及蛋白的表達(dá)水平可能是其作用機(jī)制之一，但電針是如何影響mTOR和AMPKα、mTOR與AMPKα的相互作用機(jī)制等還需進(jìn)一步行嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)來(lái)深入研究。