張玉琮 代慧英 單文娟

(新疆大學生命科學與技術學院，烏魯木齊，830046)

兔屬動物適應性強，生存環(huán)境多種多樣，而新疆是我國陸地面積第一大省，有著豐富多樣的生態(tài)環(huán)境，廣泛分布著4種野兔。包括以適應干旱著稱的塔里木盆地特有物種——塔里木兔(Lepusyarkandensis)，以適應嚴寒著稱、分布在新疆北部寒冷地區(qū)的雪兔(Lepustimidus)，分布在帕米爾高原及新疆中東部地區(qū)的藏兔(Lepustibetanus)，以及分布在塔里木盆地以北、烏魯木齊以西廣大地區(qū)的托氏兔(Lepustolai)[1]。新疆兔屬物種，是該地區(qū)十分重要的資源動物，尤其塔里木兔和雪兔被列為國家Ⅱ級保護動物[2]。野兔性別的鑒定是對野兔種群開展生態(tài)學、群體遺傳學等方面研究的前提和基礎之一。然而兔屬動物的性二型性不明顯，尤其是幼體，而且從野外收集到的組織樣本大多是不完整的，所以直接利用外部形態(tài)特征的方法鑒定性別并不合適。

研究表明，SRY 基因(Sex determining region Y gene，Y染色體性別決定基因)是哺乳動物Y染色體上起著性別決定的序列，是控制性別的睪丸決定因子(TDF)的遺傳基礎，也是胚胎發(fā)育過程中雄性個體區(qū)別于雌性個體的關鍵基因[3-4]。因此，作為性別鑒定的重要遺傳標記之一，其在遺傳病防控，家畜性別控制，動物性別鑒定等方面有著廣泛的應用[5-7]。

近些年來，隨著性別決定理論的研究，性別鑒定的方法也由個體水平、細胞水平發(fā)展到了分子水平。雖然目前已有許多種鑒定性別的方法，如核型分析法、間接免疫熒光法、Y染色體特異性DNA探針法、PCR擴增法等[8-10]。但在哺乳動物的性別鑒定中得到了廣泛應用且效果較好的仍然是利用雙重PCR法擴增SRY基因保守區(qū)的方法[11-12]。該方法是同時擴增SRY基因和APP基因(Amyloid precursor protein gene，淀粉樣前體蛋白基因)，后者是一段物種進化過程中高度保守的序列，其表達產(chǎn)物是一種廣泛存在于哺乳動物體內(nèi)的多功能跨膜蛋白[13]。

本文運用SRY基因作為雄性個體遺傳標記，APP基因作為陽性對照分別設計引物。將蛋白酶K法提取的121例野兔樣本的總DNA利用雙重PCR體系擴增出與之相對應的特異性序列，并且對擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，根據(jù)電泳條帶分析結果。利用這一方法將采自全疆9個地區(qū)的4種野兔標本進行了性別鑒定。本研究不僅有助于結合野兔形態(tài)學特征，進一步探討新疆野兔的分類、群體遺傳學和分子進化，而且對新疆野生兔類資源的保護開發(fā)和管理利用也有著一定的實際意義。

1 材料與方法

1.1 材料

10例已知性別的哺乳動物樣本，包括：雌雄各1例的野兔和家兔，雌雄各1例的豬、牛、羊家畜樣本。分別采自阿克陶、烏恰、塔縣、阿克蘇、阿拉爾、阿勒泰、達坂城、托克遜、庫爾勒9個地區(qū)121例未知性別的野兔樣本(包括皮張和肌肉組織)。

1.2 方法

1.2.1 蛋白酶K法提取基因組DNA并電泳檢測

取0.2 g組織樣剪碎放入2 mL EP管中，加500 μL HOM Buffer及10 μL 20 mg/mL蛋白酶K混合均勻，56℃水浴消化至溶液透明。再加入500 μL 2.25 M的NaCl溶液及300 μL氯仿，充分混勻15 min，10 000 rpm 離心10 min后進行抽提。將600 μL上清液轉移到另一離心管，加入等體積的異丙醇，混勻后，置于-20 ℃下2 h 以上以沉淀DNA。13 000 rpm離心10 min，棄上清液，沉淀中加入500 μL 70%乙醇，洗滌5 min后，13 000 rpm 離心10 min，棄上清液，干燥DNA沉淀。加50 μL滅菌雙蒸水，溶解DNA。

取2 μL提取產(chǎn)物，與等體積的上樣緩沖液混合，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠(含0.15% Gold View I型核酸染色劑)電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)照膠分析后，記錄結果。

1.2.2 雙重PCR擴增

依據(jù)趙建軍文獻[14]設計兩對引物，詳見表1。其中一對引物SRY282擴增Y染色體性別決定區(qū)域282 bp的片段，另一對引物APP173作為PCR反應的陽性對照擴增常染色體173 bp的片段。引物由上海生工委托合成。PCR反應的總體系為25 μL：濃度為10 μM的SRY282與APP173上下游4條引物各1 μL，13 μL PremixTaqTM溶液(PCR反應預混液)，1～3 μL的模板(根據(jù)DNA提取產(chǎn)物凝膠電泳的亮度判斷)，加無菌去離子水補足至25 μL。循環(huán)參數(shù)：首先95℃預變性4 min，然后95℃變性20 s、53℃復性30 s、72℃延伸30 s循環(huán)30次，最后72℃延伸3 min。

表1 引物序列

Tab.1 Primer sequences

1.2.3 電泳檢測

取6 μL PCR擴增產(chǎn)物，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠(含0.15% Gold View I型核酸染色劑)電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)照膠觀察，對比maker后，記錄結果。

2 結果

2.1 新疆野兔標本總DNA提取產(chǎn)物電泳結果

用蛋白酶K法提取總DNA，部分結果如圖1，基因組DNA條帶清晰，部分樣品有輕微降解且存在RNA和蛋白質雜質。總的來說，可以滿足下一步實驗要求。

圖1 新疆野兔部分標本總DNA提取產(chǎn)物電泳結果Fig.1 Total DNA extraction results of Xinjiang hares

2.2 已知性別樣本的SRY與APP基因PCR產(chǎn)物電泳結果

對已知性別的野兔、家兔、羊、牛、豬進行性別鑒定，其中野兔、家兔成功鑒定出性別。從圖2可以看出，雄性個體擴增出282 bp和173 bp兩條特異性條帶，雌性個體僅擴增出173 bp的一條特異性條帶。且鑒定結果與實際完全一致。

圖2 已知性別樣本的SRY與APP基因PCR產(chǎn)物電泳結果Fig.2 PCR results of SRY gene and APP gene in gender-known samples 注：泳道M為maker DL1 000；泳道1、2是雌性與雄性野兔的電泳結果；泳道3、4是雌性與雄性家兔的電泳結果；泳道5～10分別是牛、羊、豬3種家畜一雌一雄的電泳結果 Note：Lane M for maker DL1 000.Lane 1 and 2 were PCR results of female and male hare.Lane 3 and 4 were PCR results of female and male rabbit.Lane 5-10 were PCR results of one female and one male of cattle，sheep and pig，respectively

2.3 新疆野兔未知性別樣本的SRY與APP基因PCR產(chǎn)物電泳結果

相同反應條件下對121例未知性別的新疆野兔標本進行性別鑒定。其中有69例擴增出了173 bp的一條帶，判定為雌性個體，52例擴增出了282 bp和173 bp的兩條帶，判定為雄性個體。各采集地野兔樣本雌雄個體數(shù)目的詳細結果見表2。部分電泳結果見圖3。

表2 新疆9個采集地121例野兔樣本雌雄個體數(shù)目

Tab.2 The number of males and females in 121 Xinjiang hare samples from 9 regions

圖3 未知性別的新疆野兔樣本的SRY與APP基因部分PCR產(chǎn)物電泳結果Fig.3 PCR results of SRY gene and APP gene in gender-unknown hare samples in Xinjiang 注：泳道M為maker DL1 000；泳道1、3、4、6、9、10為雄性野兔；泳道2、5、7、8為雌性野兔 Note：Lane M for maker DL1 000.Lanes 1，3，4，6，9，10 for male hares.Lanes 2，5，7，8 for female hares

3 討論

兔類基因組DNA大小約2.81Gb(源自哺乳動物基因組計劃數(shù)據(jù)，http：//www.broad.mit.edu/ftp/pub/assemblies/mammals/rabbit/oryCun1/BasicAssemblyOneLiner.out)。本研究首先嘗試了利用CTAB法來提取野兔基因組DNA，但是提取效果不理想。之后又采用了經(jīng)典的蛋白酶K法來提取野兔肌肉或皮張的基因組DNA。由于所用的野兔樣本為2003年至今本實驗室所保存和采集的，部分樣本采集時間較為久遠，有的樣本是在路邊撿到的已風干的皮張組織，因此提取的總DNA存在輕微降解情況。

本實驗中影響PCR擴增結果的因素可能有兩點，首先，由于同一個體系內(nèi)加了2對引物，之間勢必會有引物競爭和形成引物二聚體，影響PCR的擴增效果[15]。此外，由于提取過程中只進行了一次抽提，提取產(chǎn)物仍有較多雜質，這也是影響PCR結果的原因之一。

為了防止擴增失敗而對結果造成誤判，選用雙重PCR的方法同時對SRY基因及一個與性別無關的持家基因(APP基因)進行擴增。對擴增產(chǎn)物電泳后，同時出現(xiàn)兩條帶的為雄性，一條帶的為雌性。若無任何擴增產(chǎn)物，則不能判斷性別。這一方法提高了PCR結果的可靠性，避免了結果的假陽性。本實驗先選用已知性別的4例兔屬動物和6例非兔屬動物家畜進行檢驗，兔屬動物的實際性別與實驗結果一致。雄性樣本擴增出兩條特異性條帶，分別是173 bp的APP與282 bp的SRY條帶；雌性樣本僅擴增出了173 bp的APP條帶。而非兔屬動物并未擴增出任何條帶，證明了此特異性引物的可靠性和該方法的有效性。而后我們采用此方法鑒定了121例未知性別的新疆野兔樣本，其中69例為雌性，52例為雄性。經(jīng)卡方檢驗后，χ2=2.388，P>0.05，符合1∶1的性別比例，與野兔自然種群的性別比例一致[16-18]，結果可靠。但由于各個地區(qū)的野兔標本采集數(shù)量不是足夠多，不能直接探討各小種群的性別比例，今后可以聯(lián)合野兔外形特征等數(shù)據(jù)進一步分析種群結構，探討新疆野兔的分類和系統(tǒng)發(fā)育關系，為野生兔類保護和利用奠定基礎。

4 結論

本研究通過蛋白酶K法提取了9個地區(qū)共121例新疆野兔樣本的基因組DNA。然后利用雙重PCR法鑒定出了121例野兔的性別。其中雌性69例，雄性52例，雌雄比例接近1∶1。這為今后新疆野兔其他生物學方面的深入研究提供了基礎數(shù)據(jù)資料。