阿迪力·艾合麥提 阿依努爾·阿卜杜艾尼 布威海麗且姆·阿巴拜科日，2伊拉木江·托合塔洪 塔依爾江·買買提 馬合木提·哈力克*

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊，830046；2.新疆維吾爾醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校，和田，848000)

DNA條形碼技術(shù)(DNA Barcoding technology)是通過對(duì)一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)目的基因的DNA序列進(jìn)行分析從而對(duì)物種快速鑒定的技術(shù)[1-2]?；诰€粒體DNA(mtDNA)細(xì)胞色素C氧化酶亞單位基因I(cytochromeCoxidase I，COI)序列的 DNA 條形碼技術(shù)具有操作簡便、準(zhǔn)確、不受鑒定經(jīng)驗(yàn)和標(biāo)本生態(tài)特征的限制等優(yōu)勢，在魚類、鳥類、昆蟲類的分類鑒定中廣泛應(yīng)用[3-7]。

新疆是我國面積最大的一個(gè)省區(qū)，約占我國國土總面積的1/6[8]。新疆的地域遼闊，遠(yuǎn)離海洋，具有典型的大陸性氣候特點(diǎn)，復(fù)雜的地形形成“三山夾兩盆”的地貌輪廓。氣候、植被類型多樣等生態(tài)環(huán)境為野生動(dòng)物提供了良好的棲息繁衍條件[9]。雖然新疆野生動(dòng)物資源很豐富并且國家相關(guān)機(jī)構(gòu)對(duì)野生動(dòng)物資源的保護(hù)提出了一系列對(duì)策，但是由于很多野生動(dòng)物長期被用于飲食、醫(yī)藥、觀賞和傳統(tǒng)需求并且有關(guān)監(jiān)管部門在鑒定方面存在困難，而野生動(dòng)物非法盜獵、貿(mào)易現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，導(dǎo)致野生保護(hù)動(dòng)物資源嚴(yán)重的損害[10-16]，所以在規(guī)范管理和保護(hù)執(zhí)法的過程中，野生動(dòng)物物種鑒定起著重要的作用。本研究采用DNA條形碼技術(shù)對(duì)新疆野生哺乳動(dòng)物mtDNA COI基因進(jìn)行分析，找出鑒別新疆野生哺乳動(dòng)物的最好方法，給海關(guān)、森林公安、工商管理等有關(guān)執(zhí)法部門的物種鑒定提供科學(xué)依據(jù)和數(shù)據(jù)庫的建立提供相關(guān)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究以已知的新疆野生哺乳動(dòng)物作為研究對(duì)象。實(shí)驗(yàn)樣本少數(shù)的在實(shí)驗(yàn)室保存好的以外，其他的來自烏魯木齊林業(yè)局。取樣時(shí)為避免個(gè)體重復(fù)，取樣時(shí)保證每一份標(biāo)本來自不同的個(gè)體，共包括3目6科12種52只野生哺乳動(dòng)物，所有標(biāo)本在95%酒精保存?zhèn)溆?，?biāo)本信息見表1。

1.2 方法

1.2.1 試劑及儀器

肌肉、糞便、血液標(biāo)本基因組DNA提取的試劑分別參考趙建軍、日沙來提、薩姆布魯克等人的方法配制[17-19]。COI基因通用引物L(fēng)CO1490，序列為5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′，HCO2198序列為5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′，引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR儀(德國，型號(hào)：T personal)；電泳儀(北京市六一儀器廠，型號(hào)：DYY-10C)；凝膠成像儀(美國伯樂公司，型號(hào)：Gel Doc XR+)。

1.2.2 DNA提取

模板DNA提?。簠⒄遮w建軍、日沙來提、薩姆布魯克[17-19]等人的方法從肌肉、糞便、血液中提取基因組DNA并純化，測OD260、OD280定量、溶解后在4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR反應(yīng)

反應(yīng)體系為10×緩沖液6.0 μL，2.5 mM dNTP 6.0 μL，3.7 nmol引物各 2.0 μL，TaqDNA聚合酶 1.0 μL，模板DNA 4.0 μL，ddH2O 29.0 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.2.4 DNA序列分析

采用Chrosma 2.3軟件讀取基因序列并峰圖質(zhì)量進(jìn)行判斷。若峰圖質(zhì)量不理想不能準(zhǔn)確地判斷堿基的，則重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序。用MEGA7軟件進(jìn)行比對(duì)，同時(shí)將成功測定的序列在美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST同源性比較，以確定測出來的序列是否正確。使用DnaSP 6.1 軟件分析52條序列的遺傳多樣性參數(shù)。運(yùn)用MEGA7軟件分析堿基組成，基于Kimura-2-parameter(K2P)[20]模型的不同替換類型計(jì)算各物種的種內(nèi)和種間遺傳距離。同時(shí)采用鄰居法(Neighbor jointing，NJ)和最小進(jìn)化法(Maximum evolution，ME)構(gòu)建全部COI基因序列的NJ和ME分子進(jìn)化樹，對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行內(nèi)部分支檢驗(yàn)與1 000次Bootstrap檢驗(yàn)分析，從而確定個(gè)支系的置信度。

表1 實(shí)驗(yàn)樣本信息

Tab.1 Experimental sample information

2 結(jié)果

2.1 基因組DNA濃度測定結(jié)果

基因組DNA濃度測定結(jié)果：CTAB裂解法提取的野生動(dòng)物哺乳總DNA樣本用紫外分光光度計(jì)測量260 mn、280 mn處的OD值，依據(jù)公式計(jì)算DNA濃度(μg/mL)=稀釋OD260×50×稀釋倍數(shù)。DNA純度=OD260/OD280，所得結(jié)果為1.69。

2.2 COI基因擴(kuò)增結(jié)果

共檢測片段長度為642～729 bp的52份樣本，實(shí)驗(yàn)采用的所有標(biāo)本都成功擴(kuò)增出來，這個(gè)結(jié)果與預(yù)期的目標(biāo)片段COI基因的長度相符合，取每種野生哺乳動(dòng)物PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，未出現(xiàn)引物二聚體和非特異雜帶，結(jié)果見圖1。

圖1 11種野生哺乳動(dòng)物PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification product of 11 wild mammals 注：M：DL2000 DNA Marker；1.盤羊Ovis ammon；2.鵝喉羚Gazella subgutturosa；3.藏羚Pantholops hodgsoni；4.巖羊Pseudois nayaur；5.北山羊Capra sibirica；6.藏原羚Procapra picticaudata；7.蒙古野驢Equus hemionus；8.雪兔Lepus timidus；9.雪豹Uncia uncia；10.馬鹿Cervus elaphus；11.狍Capreolus pygargus

2.3 遺傳多樣性和堿基組成分析

該研究所得的全部COI基因序列用DnaSP 6.1軟件分析，結(jié)果表示：52條COI基因序列分到29個(gè)單倍型，共發(fā)現(xiàn)256個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，391個(gè)突變位點(diǎn)。單倍型多樣性Hd：0.965，核苷酸多樣性Pi：0.1396。52條COI基因序列堿基分析結(jié)果所示：全部COI基因序列當(dāng)中A、T、C和G的平均含量分別為26.3%、30.3%、26.0%和17.4%，A+T含量(56.6%)高于C+G含量(43.4%)。最高的狍A+T含量61.1%，G+C含量38.9%。最低的蒙古野驢A+T含量53.5%，G+C含量46.5%。

2.4 COI基因序列同源性比對(duì)

對(duì)新疆3目6科12屬12種52只野生哺乳動(dòng)物mtDNA COI基因序列進(jìn)行同源性比較分析。結(jié)果COI基因序列同源性達(dá)到98%～100%，相似度達(dá)到90%～99%，結(jié)果見表2。

2.5 樣本分子進(jìn)化樹

基于Kimura-2-parameter(K2P)模型的不同替換類型計(jì)算種內(nèi)和種間遺傳距離，發(fā)現(xiàn)替換類型Syn-Nonsynonomous、替換種類Nonsynonymous only時(shí)的結(jié)果最好，各野生哺乳動(dòng)物種內(nèi)遺傳距離0%～2%，種間遺傳距離為15%～42%(北山羊和雪豹各有1個(gè)標(biāo)本，無法計(jì)算種內(nèi)遺傳距離)?；贑OI基因序列構(gòu)建6科12種野生哺乳動(dòng)物系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

表2 新疆12種野生哺乳動(dòng)物樣品測序比對(duì)結(jié)果

Tab.2 Comparative results of 12 species of wild mammals in Xinjiang

圖2 基于COI基因序列構(gòu)建的12種野生哺乳動(dòng)物系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 12 Wild mammal phylogenetic trees constructed based on COI gene sequences 分支上的數(shù)字分別表示NJ樹和ME樹的置信度(分支有差異的不顯示)，每個(gè)標(biāo)本用已知的學(xué)名來記標(biāo)本號(hào) The numbers on the branches indicate the confidence of the NJ tree and the ME tree(the difference on the branch does not display)，each specimen number was record by the known scientific name of the sample

3 討論

野生動(dòng)物資源是一種可更新的，有著巨大生產(chǎn)力的自然資源。一直以來，野生動(dòng)物資源為人們做出了很大的貢獻(xiàn)，只要科學(xué)地保護(hù)和管理野生動(dòng)物資源，就可以對(duì)它們持續(xù)利用而造福于人類[21]。目前新疆已被記錄的野生脊椎動(dòng)物有726種。就哺乳動(dòng)物而言，新疆有154種野生獸類，占中國哺乳動(dòng)物種類的37.4%，其有很多新疆野生珍稀特有物種[22-23]。采用DNA條形碼技術(shù)能進(jìn)一步提高海關(guān)、工商管理、森林公安等有關(guān)執(zhí)法部門的物種鑒定水平并彌補(bǔ)其他物種鑒定方法，控制野生保護(hù)動(dòng)物的貿(mào)易、偷獵、飲食等非法行為，從而為野生動(dòng)物的科學(xué)保護(hù)和管理起重要作用。

本研究對(duì)采集于新疆3目6科12屬12種52只野生哺乳動(dòng)物mtDNA COI基因進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象包括：錄入國務(wù)院1988年7月批準(zhǔn)的中國《國家重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物名錄》的國家級(jí)重點(diǎn)保護(hù)的動(dòng)物有10種，其中Ⅰ級(jí)保護(hù)動(dòng)物有4種(雪豹、蒙古野驢、藏羚和北山羊)，Ⅱ級(jí)保護(hù)動(dòng)物有6種(馬鹿、盤羊、巖羊、藏原羚、鵝喉羚和塔里木兔)；錄入中國《國家保護(hù)的有益的或者有重要經(jīng)濟(jì)、科學(xué)研究價(jià)值的陸生野生動(dòng)物名錄》的有2種(狍和野豬)[24]。從研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：經(jīng)典酚-氯仿法、改良的CTAB裂解法適用于取提取新疆野生動(dòng)物基因組DNA，本研究所得的DNA純度1.69，純度比值在1.6～1.8范圍內(nèi)說明所得的DNA純度較高[25]。物種多樣性、遺傳多樣性分析結(jié)果雖然比較高，但人均資源量還是很少，加上我國經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展時(shí)期，因此，野生動(dòng)物資源的保護(hù)仍然面臨著嚴(yán)峻的形勢。mtDNA COI基因堿基組成分析結(jié)果有明顯的堿基偏倚性，這個(gè)結(jié)果符合線粒體DNA的堿基組成特點(diǎn)。已知的52種野生哺乳動(dòng)物mtDNA COI 基因序列同源性比較，發(fā)現(xiàn)已知的52只野生哺乳動(dòng)物和mtDNA COI基因序列同源性鑒定結(jié)果高度一致，說明測出來的序列是正確的。從系統(tǒng)進(jìn)化樹可見，基于Kimura-2-parameter(K2P)模型計(jì)算各野生哺乳動(dòng)物的種內(nèi)和種間遺傳距離，替換類型為Syn-Nonsynonomous、替換種類為Nonsynonymous only時(shí)種內(nèi)遺傳距離0%～2%，種間遺傳距離為15%～42%，二者的分離程度比其他類型較遠(yuǎn)，發(fā)生誤判的概率就很低。兩種方法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)大致相同，同一個(gè)科、屬和種均能夠被明確地分入相應(yīng)的分支，但是置信度較低，仍存在不足。此外，各個(gè)種間遺傳距離不同，而現(xiàn)有的DNA條形碼COI基因數(shù)據(jù)的物種判斷閾值可能對(duì)物種鑒定造成一定誤判。

綜上所述，DNA條形碼COI基因能夠用于新疆野生哺乳動(dòng)物的分類鑒定，該技術(shù)不僅彌補(bǔ)傳統(tǒng)物種鑒定中的模式標(biāo)本的依賴性、專業(yè)經(jīng)驗(yàn)方的限制，而且在動(dòng)物個(gè)體不完整的情況下進(jìn)行種類鑒定擁有絕對(duì)優(yōu)勢。它將對(duì)野生動(dòng)物資源的保護(hù)，控制野生保護(hù)動(dòng)物的貿(mào)易、偷獵、飲食等違法行為等方面起到積極作用，為海關(guān)、森林公安、工商管理等有關(guān)執(zhí)法部門提供有效、快速、精確的物種鑒定平臺(tái)，保護(hù)野生動(dòng)物資源中有重要意義。