牛鑫鑫 馮 濤 何紀(jì)元 薛 原 曾祥偉

(東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，哈爾濱，150040)

超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended-spectrumβ-lactamases，ESBLs)，是指細(xì)菌產(chǎn)生的能水解β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的滅活酶，能通過接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)等形式使耐藥基因在細(xì)菌中擴(kuò)散，是細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的主要機(jī)制[1]。1983年，產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的克雷伯菌(Klebsiellaspp.)首次在德國報(bào)道后，產(chǎn)ESBLs細(xì)菌的流行在世界范圍被廣泛報(bào)道[2]。ESBLs主要存在于臨床分離的革蘭陰性桿菌，其中以腸桿菌科(Enterobacteriaceae)大腸埃希菌(Escherichiacoli)和克雷伯菌最為常見[3-5]。研究證實(shí)，產(chǎn)ESBLs菌具有交叉耐藥和多重耐藥性，易導(dǎo)致耐藥菌的傳播和獲得性感染的暴發(fā)，目前產(chǎn)ESBLs 菌株的廣泛流行和傳播已成為臨床治療的突出問題[1，6]。

細(xì)菌在持續(xù)的各種β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的選擇和進(jìn)化壓力下，被誘導(dǎo)產(chǎn)生活躍且不斷變異的β-內(nèi)酰胺酶。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，已有超過400種的ESBLs型別被報(bào)道，但不同國家或地區(qū)對(duì)抗菌藥物的使用劑量、時(shí)間、臨床經(jīng)驗(yàn)用藥差異，導(dǎo)致基因型及基因亞型也存在明顯差異[7]。其中主要流行的是 TEM 型、SHV 型、CTX-M 型和OXA 型 ESBLs[8]。近年來，CTX-M 型傳播迅速，已經(jīng)開始替代TEM 型和SHV 型成為全世界最流行的ESBLs。我國的報(bào)道也顯示，CTX-M 型正逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位，這一現(xiàn)象，可能與臨床治療腸桿菌感染時(shí)頭孢噻肟比頭孢他啶運(yùn)用更多且用量更大有關(guān)[9]。大腸桿菌(Escherichiacoli)是產(chǎn)ESBLs的主代表菌株[10]。

東北虎林園是世界上最大的東北虎飼養(yǎng)和繁育基地、國家東北虎種源繁育基地、國家級(jí)陸生野生動(dòng)物疫源疫病監(jiān)測站。因此，開展產(chǎn)ESBLs虎源大腸桿菌耐藥性流行病學(xué)調(diào)查與優(yōu)勢基因型分析，為闡明虎源大腸桿菌耐藥與產(chǎn)酶關(guān)系，控制ESBLs 菌株在虎群感染和流行，指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物有重要意義。本研究調(diào)查了東北虎林園中虎源大腸桿菌中不同型別ESBLs的流行情況，為明確菌株耐藥基因潛在的播散趨勢，有效監(jiān)控細(xì)菌耐藥性，指導(dǎo)東北虎的疾病防治用藥，有效保護(hù)東北虎的種群奠定基礎(chǔ)。

1 研究方法

1.1 細(xì)菌的分離、純化培養(yǎng)及藥敏實(shí)驗(yàn)

將從東北虎林園中采集的糞便樣本，接菌劃線于麥康凱瓊脂平板，于37 ℃恒溫培養(yǎng)；挑取上述培養(yǎng)體系中單個(gè)紅色可疑菌落，劃線于伊紅美藍(lán)瓊脂平板，仍于37 ℃恒溫培養(yǎng)；對(duì)上述培養(yǎng)體系中可疑紫黑色帶金屬光澤菌落進(jìn)行抹片、革蘭氏染色，鏡檢。鑒定為大腸桿菌的菌株，在無菌環(huán)境下，接種于普通肉湯培養(yǎng)基，37 ℃進(jìn)行恒溫純培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)采用藥敏片見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)使用藥敏片名錄

Tab.1 Drug sensitive tablets list in this study

注：CAZ，CTX，購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司；其余藥敏片購自杭州天和微生物試劑有限公司和OXIOD公司

Note：CAZ，CTX，purchased from the Beijing Tiantan Pharmacy Biological Research & Development Company.Others are from Hangzhou Tianhe Microorganism Reagent Co.，Ltd.and OXIOD company

1.2 細(xì)菌ESBLs檢測

按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作和觀察判斷[11]。

1.2.1 初步篩選實(shí)驗(yàn)

初篩試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：CAZ≤22 mm，CRO ≤25 mm，CTX≤27 mm，AZT≤27 mm，樣本即為產(chǎn)ESBLs菌株。實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照：大腸桿菌ATCC25922。

1.2.2 表型確證試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)需將受試菌均勻涂布在M-H 瓊脂平板上，分別貼CAZ、CAZ/Clav 和CTX、CTX/Clav 兩組紙片，之后于37 ℃恒溫培養(yǎng)16 h，若任一組加克拉維酸比不加克拉維酸的抑菌圈直徑≥5 mm，即可確認(rèn)為產(chǎn)ESBLs菌株。

1.3 ESBLs基因的PCR 擴(kuò)增及序列分析比較

1.3.1 引物的設(shè)計(jì)合成

實(shí)驗(yàn)引物參考Van等設(shè)計(jì)的引物[12]，引物合成由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

1.3.2 PCR擴(kuò)增模板的制備

將30株虎源大腸桿菌分別接種于的LB瓊脂培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)；挑取單個(gè)菌落接種于LB 液體中，37 ℃恒溫?fù)u床孵育12 h，使用按吸附柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒DNA。

1.3.3 不同型ESBLs基因的PCR檢測

使用PCR擴(kuò)增試劑盒(TakaRa公司)，進(jìn)行SHV、CTX-M、TEM、OXA基因的PCR檢測。

PCR擴(kuò)增體系為25 μl：Taq酶 0.25 μL，dNTP 2 μL，10×buffer 2.5 μL，模板DNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，去離子水18.25 μL。

反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，退火1 min，退火溫度56.5℃，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)反應(yīng)循環(huán)，72℃延伸5 min。

2 結(jié)果

2.1 ESBLs檢測結(jié)果

ESBLs檢測結(jié)果顯示，各藥對(duì)質(zhì)控菌的抑菌圈均符合CISI 規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。初篩檢測試驗(yàn)中，21株大腸桿菌為疑似產(chǎn)ESBLs 菌株。經(jīng)過確證試驗(yàn)，21株疑似株均為產(chǎn)ESBLs菌株，陽性率為70%。

2.2 SHV、CTX-M、TEM 、OXA基因的檢測結(jié)果

PCR結(jié)果顯示：30株虎源大腸桿菌中，blaTEM基因陽性率為80%，陽性菌株24；blaCTX-M基因陽性率為50%，陽性菌株15；blaSHV基因陽性率為6.67%，陽性菌株2；blaOXA基因陽性率為20%，陽性菌株6。

圖1 blaCTX-M基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification product of blaCTX-M geneM.Marker 2kb；A.陰性對(duì)照；B-F.blaCTX-M基因M.Marker 2kb，A.negative control，B-F.the result of blaCTX-M gene

圖2 TEM基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification product of TEM geneM.Marker 2kb；A.陰性對(duì)照；B-D.TEM基因M.Marker 2kb，A.negative control，B-D.the result of TEM gene

圖3 SHV基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplification product of SHV geneM.Marker 2kb；A.陰性對(duì)照；B.SHV基因M.Marker 2kb，A.negative control，B.the result of SHV gene

圖4 OXA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR amplification product of OXA geneM.Marker 2kb；A.陰性對(duì)照；B-G.OXA基因M.Marker 2kb，A.negative control，B-G.the result of OXA gene

2.3 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物，產(chǎn)酶菌(21株)比不產(chǎn)酶菌(9株)的耐藥率高，其中產(chǎn)酶菌對(duì)AMP耐藥率最高，為100 %。9株非產(chǎn)酶菌對(duì)AZT高度敏感。不同抗菌藥對(duì)30株虎源大腸桿菌耐藥率見圖5。

圖5 30 株虎源大腸桿菌對(duì)抗菌藥藥敏試驗(yàn)?zāi)退幝蔉ig.5 Antibiotic susceptibility and resistance rates of 30 E.coli strains form tiger against agents

3 討論

抗生素和各類化學(xué)合成藥物的使用和推廣，對(duì)人類和動(dòng)物的醫(yī)療發(fā)展進(jìn)程起到了積極重要的推動(dòng)作用。然而，由于抗菌藥物的不合理使用，使細(xì)菌耐藥性和多重耐藥菌的出現(xiàn)成為臨床疾病防治中的重要難題。細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制有多種，其中產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)，并由質(zhì)粒介導(dǎo)傳播是導(dǎo)致革蘭陰性菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥性產(chǎn)生和擴(kuò)散的重要機(jī)制[1，13]。自1983年，首例產(chǎn)ESBLs的克雷伯菌在德國報(bào)道后，產(chǎn)ESBLs菌株在世界范圍被廣泛發(fā)現(xiàn)和報(bào)道，其中以腸桿菌科的大腸埃希菌和克雷伯菌最為常見[6]。ESBLs能水解3代頭孢菌素和單環(huán)酰胺酶類，但能被BIA抑制劑所抑制[13]。值得關(guān)注的是，產(chǎn)ESBLs細(xì)菌株攜帶的質(zhì)?？赡芡瑫r(shí)帶有氨基糖苷類、氯霉素、四環(huán)素、磺胺類和氟喹諾酮類等多種藥物的耐藥基因[14]，使其具有多重耐藥表型，使病原菌株擁有更大的擴(kuò)散優(yōu)勢，從而嚴(yán)重威脅臨床治療。

近年來，各地產(chǎn)ESBLs菌株的檢出率更是逐年上升，漸呈世界性流行的趨勢，但不同地區(qū)流行的基因型存在明顯差異[13]。例如，F(xiàn)ortini 等[15]研究表明尼日利亞健康雞和豬中ESBLs流行主要為TEM基因；Guenther 等[16]研究顯示蒙古和德國野生鳥類中ESBLs流行主要為CTX-M型；而在中國，苑麗等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在河南省的雞群中TEM和CTX-M基因型均有流行；Liao等[18]研究進(jìn)一步證明，中國病死家禽中ESBLs流行以CTX-M型為主，且以CTX-M-27 型最為流行。Livermore等[19]研究則發(fā)現(xiàn)歐洲各國產(chǎn)ESBLs耐藥菌的類型正逐漸從以TEM、SHV型變?yōu)橐訡TX-M型為主。目前，對(duì)耐藥性檢測主要集中在家畜家禽的研究，國內(nèi)對(duì)野生動(dòng)物和圈養(yǎng)野生動(dòng)物的ESBLs檢測工作較少，而開展ESBLs監(jiān)測，有效掌握多種耐藥基因的流行情況，防止耐藥菌株的擴(kuò)散爆發(fā)，對(duì)指導(dǎo)臨床有效用藥，保護(hù)瀕危物種是非常必要的。

東北虎林園是為挽救和保護(hù)世界瀕危物種東北虎而建立，為了更好地了解產(chǎn)ESBLs菌株在東北種群中流行情況，本實(shí)驗(yàn)對(duì)30株虎源大腸桿菌進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，30株虎源大腸桿菌中，有21株為產(chǎn)ESBLs菌株，陽性率高達(dá)70%。其中，TEM基因檢出的陽性例數(shù)為24例，陽性率達(dá)80%，是東北虎林園主要的β-內(nèi)酰胺酶型別。與許穎等[20]的研究結(jié)果：產(chǎn)ESBLs大腸桿菌主要型別為TEM型，其對(duì)青霉素類抗生素具有較強(qiáng)耐藥性的結(jié)果類似。CTX-M基因的檢出率為50%，是僅次于TEM型的主要流行基因亞型。SHV型基因主要位于克雷伯菌中，本次實(shí)驗(yàn)SHV基因的檢出率僅為6.67%。OXA型ESBLs國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道主要存在于銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌中[21]，而在腸桿菌科細(xì)菌中所占比例較少，國內(nèi)相關(guān)報(bào)道也較少，但是本研究發(fā)現(xiàn)OXA型基因在東北虎林園中檢出。另外，對(duì)比發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)酶大腸桿菌比非產(chǎn)酶大腸桿菌的耐藥性更高。應(yīng)加強(qiáng)對(duì)東北虎林園菌株耐藥性監(jiān)測，探索耐藥基因的分子流行病學(xué)規(guī)律，嚴(yán)格掌控抗菌藥物使用，從而有效降低動(dòng)物感染的概率。建議采用定期輪換藥物的方式用藥，以避免耐藥性的產(chǎn)生和擴(kuò)散。