余昌萌 余 瑤 吳登虎 周 俊* 葉兵兵

(1.四川民族學(xué)院，康定，626001；2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院，重慶，400038；3.重慶動(dòng)物園，重慶，400050)

自20世紀(jì)60年代初，重慶動(dòng)物園圈養(yǎng)大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)已有約60年歷史，在此期間重慶動(dòng)物園開展了多次野外救護(hù)大熊貓的工作，先后救護(hù)了50～60只大熊貓，最多的時(shí)候，動(dòng)物園內(nèi)大熊貓數(shù)量多達(dá)20只。如今，重慶動(dòng)物園內(nèi)現(xiàn)存大熊貓12只，已成為圈養(yǎng)大熊貓數(shù)量最多的城市動(dòng)物園之一。截至2016年7月，重慶動(dòng)物園共繁殖大熊貓20胎25只，成活15只，其中雙胞胎5胎；2016年7月11日“蘭香”順利產(chǎn)下的龍鳳胎“渝寶”“渝貝”也是重慶動(dòng)物園繁殖大熊貓以來，雙胞胎同時(shí)存活的首例。

近年來，隨著科研事業(yè)的發(fā)展，在大熊貓繁育學(xué)、營(yíng)養(yǎng)學(xué)、行為學(xué)及獸醫(yī)學(xué)等方面取得了較為顯著的成果，大熊貓血液參數(shù)儼然成為臨床獸醫(yī)及動(dòng)物管理者對(duì)大熊貓進(jìn)行健康評(píng)估的最基本評(píng)判指標(biāo)。由于受到地域差異、種群數(shù)量及樣品收集方式等多方面的限制，國(guó)內(nèi)外對(duì)于大熊貓血液學(xué)系統(tǒng)的報(bào)道較為有限；李才武[1]、李光漢等[2]、王強(qiáng)等[3]和 Chen等[4]早年發(fā)表了一些關(guān)于圈養(yǎng)大熊貓的血液生理生化參數(shù)，但以往采取動(dòng)物血液多數(shù)是在麻醉情況下進(jìn)行的[5]，已有多篇報(bào)道相繼指出麻醉對(duì)動(dòng)物有較大的應(yīng)激反應(yīng)，且對(duì)血液的某些生理生化指標(biāo)產(chǎn)生了較大影響[6]。為了建立非干擾狀態(tài)下大熊貓正常生理生化指標(biāo)的參考范圍，成都大熊貓繁育研究基地于2017年首次報(bào)道了有關(guān)大熊貓的50項(xiàng)在非干擾狀態(tài)下血液生理生化指標(biāo)的正常參考范圍。由于血液生理參數(shù)不僅受到遺傳因素的影響還受到環(huán)境因素的影響[7]，成、渝兩地及其他各地之間存在著較大的差異，大熊貓血液可能因環(huán)境氣候、飼養(yǎng)方式等因素使得各項(xiàng)指標(biāo)有所差異。因此該篇報(bào)道中的參數(shù)指標(biāo)更適用于成都地區(qū)圈養(yǎng)大熊貓種群健康水平的評(píng)估[8]。

重慶動(dòng)物園為了建立適用于本地大熊貓?jiān)诜锹樽頎顟B(tài)下正常生理生化參考范圍，在經(jīng)過長(zhǎng)期馴化之后，選取了本園內(nèi)可獲得的9只健康大熊貓作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，共采得54個(gè)血樣分別進(jìn)行了58項(xiàng)常規(guī)血液學(xué)指標(biāo)檢測(cè)。本次研究就現(xiàn)有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，建立了重慶動(dòng)物園大熊貓?jiān)诜锹樽頎顟B(tài)下血液生理生化指標(biāo)的正常參考范圍，不僅有助于獸醫(yī)對(duì)大熊貓的健康狀態(tài)進(jìn)行有效的評(píng)估，及早發(fā)現(xiàn)隱情，還有利于動(dòng)物管理者的日常管理工作，同時(shí)又為其他大熊貓飼養(yǎng)機(jī)構(gòu)提供了可靠的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 受試動(dòng)物

本次受試動(dòng)物均由重慶動(dòng)物園飼養(yǎng)，年齡為2～35歲不等，具體性別及年齡分組見表1，具體個(gè)體信息見表2。所有受試動(dòng)物在受試期間精神狀態(tài)、吃食狀態(tài)及大小便均正常者視為健康個(gè)體，并在采血前2周提前進(jìn)入特別觀察期。在此期間大熊貓進(jìn)行正常的投食、驅(qū)蟲、疫苗注射及行為訓(xùn)練工作。大熊貓的分組是根據(jù)性成熟狀態(tài)進(jìn)行的，將未參與交配的(5歲以下)視為亞成體(含幼體)大熊貓，參與交配的(5～20歲)視為成年大熊貓，20歲以上者視為老年大熊貓[6]。

表1 受試大熊貓年齡與性別分組

Tab.1 Age and sex groups of giant pandas

表2 大熊貓個(gè)體信息

Tab.2 Giant panda personal information form

續(xù)表2

1.1.2 儀器設(shè)備

實(shí)驗(yàn)儀器包括：(1)離心機(jī)：TD-5M-1臺(tái)式低速離心機(jī)。(2)血常規(guī)檢測(cè)儀：XT-2000(SYSMEX，日本)。(3)生化檢測(cè)儀：VIROS5600(SYSMEX，日本)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 采樣方法

通過長(zhǎng)期的行為訓(xùn)練，使大熊貓自愿伸出左上肢或者右上肢，剔除其前臂皮毛暴露靜脈血管，用一次性靜脈采血針(規(guī)格mm：0.7×25)和真空采血管進(jìn)行血液采集工作。所獲血樣低溫保存，1 h之內(nèi)進(jìn)行血液生理生化指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.2 檢測(cè)方法

將所有血樣分為2份，1份為EDTA抗凝管，1份為無抗凝劑離心分離血清(4 000 r/min 10 min)，送往重慶市西南醫(yī)院進(jìn)行正常生理生化檢測(cè)。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析

所得數(shù)據(jù)通過SPSS(IBM SPSS Statistics 22.0)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。將各個(gè)受試動(dòng)物在同一年齡段的所有血液檢測(cè)結(jié)果平均所得的平均值作為該受試動(dòng)物在此階段的最終檢測(cè)值。血液生理生化的正常范圍將通過平均值、標(biāo)準(zhǔn)差及個(gè)體數(shù)量體現(xiàn)，即每個(gè)受試動(dòng)物先按照年齡組分別進(jìn)行平均值和標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算，將超過平均值±3×標(biāo)準(zhǔn)差的數(shù)據(jù)不再進(jìn)行之后的計(jì)算和檢測(cè)[8-9]。將符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進(jìn)行T檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的進(jìn)行非參檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

本研究共檢測(cè)得重慶大熊貓血液正常生理生化指標(biāo)參考范圍58項(xiàng)(表3)，根據(jù)年齡(表3)、性別(表4)、地域(表5)等的不同，分組統(tǒng)計(jì)分析，其結(jié)果如下。

2.1 不同年齡段之間進(jìn)行T—獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，部分指標(biāo)呈現(xiàn)顯著性差異，主要表現(xiàn)為：(1)幼年組與成年組：?jiǎn)魏思?xì)胞、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、鈣、磷、甘油三酯等指標(biāo)呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)；平均紅細(xì)胞體積、平均血紅蛋白含量、堿性磷酸酶等指標(biāo)呈現(xiàn)極顯著性差異(P<0.01)。(2)幼年組和老年組：平均紅細(xì)胞體積、平均血紅蛋白含量、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總蛋白、球蛋白、白球比值、總膽汁酸、乳酸脫氫酶、鈣、葡糖糖、鎂、高密度脂蛋白膽固醇等指標(biāo)呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)；白細(xì)胞、堿性磷酸酶等指標(biāo)呈現(xiàn)極顯著性差異(P<0.01)。(3)青年組與老年組：淋巴細(xì)胞、總蛋白、球蛋白、鈣、磷、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇等指標(biāo)呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)；白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等指標(biāo)呈現(xiàn)極顯著差異(P<0.01)。

2.2 不同性別之間經(jīng)T—獨(dú)立樣本檢驗(yàn)分析，除肌酐有顯著性差異外，其余指標(biāo)均未呈現(xiàn)出顯著性差異；再經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)分析，其中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶等呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)，堿性磷酸酶、直接膽紅素、尿酸、肌酐、磷、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇等指標(biāo)呈現(xiàn)極顯著性差異(P<0.01)。再將其進(jìn)行非參檢驗(yàn)中的2 independent samples檢驗(yàn)分析，除乳酸脫氫酶有顯著性差異外，其余指標(biāo)仍未出現(xiàn)顯著性差異。

2.3 成、渝兩地之間進(jìn)行T—單個(gè)樣本檢驗(yàn)分析比較，主要表現(xiàn)為：(1)幼年組：谷丙轉(zhuǎn)氨酶、白蛋白、白球蛋白比值、總膽紅素、直接膽紅素、乳酸脫氫酶、鈉、尿素、尿酸、肌酐、葡萄糖、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、紅細(xì)胞、平均紅細(xì)胞體積、平均血紅蛋白含量、紅細(xì)胞體積分布寬度(CV)、紅細(xì)胞體積分布寬度(SD)、淋巴細(xì)胞百分比、中性粒細(xì)胞百分比、嗜堿性粒細(xì)胞百分比等指標(biāo)呈現(xiàn)極顯著性差異(P<0.01)；堿性磷酸酶、球蛋白、鉀、氯、鈣、總膽固醇、白細(xì)胞、血紅蛋白等指標(biāo)呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)。(2)平均紅細(xì)胞體積、平均血紅蛋白含量、平均血紅蛋白濃度、中性粒細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞百分比、單核細(xì)胞百分比、紅細(xì)胞體積分布寬度(CV)、紅細(xì)胞體積分布寬度(SD)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、白蛋白、總膽紅素、直接膽紅素、乳酸脫氫酶、尿酸、肌酐低密度脂蛋白膽固醇等指標(biāo)呈現(xiàn)極顯著性差異(P<0.01)；堿性磷酸酶呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)。(3)老年組：平均紅細(xì)胞體積、平均血紅蛋白含量、中心粒細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞百分比、嗜堿性粒細(xì)胞百分比、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、白球比值、總膽紅素、直接膽紅素、乳酸脫氫酶、尿素、磷等指標(biāo)呈現(xiàn)極顯著性差異(P<0.01)；白細(xì)胞、單核細(xì)胞百分比、紅細(xì)胞體積分布寬度(SD)、白蛋白、球蛋白、鈉、氯、尿酸、肌酐等指標(biāo)呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)。

表3 幼年、成年和老年組大熊貓生理生化指標(biāo)

Tab.3 Hematologic and biochemical reference of infant、adult and aged giant pandas

續(xù)表3

注：針對(duì)常用血液生理生化指標(biāo)進(jìn)行差異性檢驗(yàn)，標(biāo)有相同字母的為差異不顯著(P>0.05)，標(biāo)有不同字母的為差異顯著(P<0.05)，未標(biāo)字母的未進(jìn)行差異性檢驗(yàn)

Note：For the difference test of commonly used blood physiological and biochemical indicators，the difference with the same letter is not significant(P>0.05)，the difference with different letters is significant(P<0.05)，and the unmarked letter is not tested differently

表4 雌性、雄性大熊貓生理生化指標(biāo)

續(xù)表4

表5 成、渝兩地比較

Tab.5 Comparison between in Chongqing and in Chengdu

續(xù)表5

續(xù)表5

注：該表中成都大熊貓數(shù)據(jù)參考于羅娌先前報(bào)道數(shù)據(jù)，標(biāo)有**的為極顯著差異(P<0.01)，標(biāo)注*的為顯著性差異(P<0.05)，未標(biāo)注的無顯著性差異

Note：The Chengdu giant panda data in this table refers to the data previously reported by Luoli.The marked**is a very significant difference(P<0.01)，and the marked*is a significant difference(P<0.05).There is no significant difference

3 討論

3.1 本研究就重慶動(dòng)物園內(nèi)可獲得的9只大熊貓進(jìn)行了首次較為系統(tǒng)的非麻醉狀態(tài)采血，并詳細(xì)報(bào)道了非麻醉狀態(tài)下圈養(yǎng)大熊貓不同年齡段和不同性別的血液生理生化指標(biāo)參考范圍。本研究完全排除了麻醉這一應(yīng)激原，且均在各只大熊貓正常健康狀態(tài)下進(jìn)行，所得數(shù)據(jù)能夠真實(shí)地反映大熊貓血液各項(xiàng)指標(biāo)的實(shí)際檢測(cè)結(jié)果，為獸醫(yī)及研究工作者對(duì)大熊貓進(jìn)行健康評(píng)估提供更為可靠的評(píng)判依據(jù)。

3.2 不同年齡組血液生理生化指標(biāo)比較

不同年齡組血液生理生化指標(biāo)體現(xiàn)為：(1)隨著年齡的增長(zhǎng)部分血液指標(biāo)表現(xiàn)為幼年較低，成年后增長(zhǎng)到峰值，老年后維持不變或有所下降，如血紅蛋白、肌酐、直接膽紅素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、甘油三酯及總膽固醇等，其中各類酶波動(dòng)較大，主要是由于酶容易受到應(yīng)激、飲食、劇烈運(yùn)動(dòng)等的干擾。(2)隨著年齡的增長(zhǎng)部分血液指標(biāo)如鈣、磷、堿性磷酸酶等表現(xiàn)為呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)。其主要原因是幼年動(dòng)物處于一個(gè)迅速生長(zhǎng)階段，而堿性磷酸酶是能夠反映骨形成及成骨細(xì)胞代謝活性的一個(gè)重要指標(biāo)[8]。(3)隨著年齡的增長(zhǎng)至成年時(shí)期，部分血液指標(biāo)如白細(xì)胞數(shù)目、淋巴細(xì)胞數(shù)目等略呈下降趨勢(shì)，而到了老年時(shí)又逐漸上升；部分血液指標(biāo)如血紅蛋白、血小板等在幼年期時(shí)最低，成年后趨于穩(wěn)定，而到老年時(shí)又開始逐漸下降。

3.3 不同性別之間血液生理生化指標(biāo)比較

將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行T檢驗(yàn)和非參檢驗(yàn)中的2 independent samples 檢驗(yàn)均得出雌、雄個(gè)體之間血液指標(biāo)差異不顯著，與王強(qiáng)[3]等所報(bào)道的結(jié)果一致，但其平均值及方差結(jié)果相差較大。主要表現(xiàn)為白細(xì)胞數(shù)目、淋巴細(xì)胞、血小板、甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇及低密度脂蛋白膽固醇等雌性個(gè)體均高于雄性個(gè)體，這與Mainks等[10]、羅娌等[8]所報(bào)道結(jié)果一致。因此，臨床上對(duì)不同性別的大熊貓應(yīng)給與區(qū)別對(duì)待。

3.4 成、渝兩地圈養(yǎng)大熊貓血液生理生化指標(biāo)比較

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分指標(biāo)與李光漢等[2]、王強(qiáng)等[3]和羅娌等[8]曾報(bào)道過的成都圈養(yǎng)大熊貓血液正常生理生化指標(biāo)表現(xiàn)出一定程度的差異，主要體現(xiàn)為：(1)反映動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)狀況的各項(xiàng)指標(biāo)如總蛋白、白蛋白、血紅蛋白等表現(xiàn)為略低。(2)反映動(dòng)物肝功的各項(xiàng)指標(biāo)如總膽紅素、總間接膽紅素和直接膽紅素等表現(xiàn)為各年齡段指標(biāo)普遍高于羅娌等[8]所報(bào)道的，但與王強(qiáng)等[3]報(bào)道的無明顯差異。(3)反映腎功的各項(xiàng)指標(biāo)如尿素、尿酸和肌酐等表現(xiàn)為各年齡段指標(biāo)普遍低于之前報(bào)道水平。(4)其他指標(biāo)如總膽固醇、甘油三酯等均低于之前報(bào)道水平。各項(xiàng)血液生理生化指標(biāo)雖反映著動(dòng)物機(jī)體狀況，出現(xiàn)較大的差異不僅受到動(dòng)物性別、年齡、生活環(huán)境及營(yíng)養(yǎng)水平的影響，還受到測(cè)定方法以及動(dòng)物采食、運(yùn)動(dòng)、應(yīng)激等多方面因素的影響，如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，營(yíng)養(yǎng)水平良好時(shí)將表現(xiàn)為血液中膽固醇和甘油三酯含量偏高[11]；當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)將表現(xiàn)為球蛋白偏高，白蛋白、球蛋白嚴(yán)重倒置[12]等。

本文就所得研究結(jié)果與羅娌[8]等所報(bào)道的結(jié)果通過T—單個(gè)樣本檢驗(yàn)對(duì)不同年齡段的指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，不同年齡段之間均有指標(biāo)表現(xiàn)為極顯著性或顯著性差異，主要體現(xiàn)在平均紅細(xì)胞體積、平均血紅蛋白含量、中心粒細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞百分比、嗜堿性粒細(xì)胞百分比、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、白球比值、總膽紅素、乳酸脫氫酶、尿素、磷等指標(biāo)呈現(xiàn)極顯著性差異(P<0.01)；白蛋白、球蛋白、肌酐等指標(biāo)呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)。導(dǎo)致差異性的原因可能是成、渝兩地環(huán)境氣候、管理方式及個(gè)體數(shù)目等的不同。具體分析如下：(1)成、渝雖同處四川盆地，但分處東西兩端；雖均屬亞熱帶季風(fēng)性氣候，但兩地夏季氣候相差較大，成都較重慶氣溫普遍偏低。成都海拔落差大而且晝夜溫差大，對(duì)動(dòng)物生理機(jī)能影響較大，如溫度較高可能致使動(dòng)物組織細(xì)胞受到氧化損傷，膜受到破壞，通透性增加，導(dǎo)致血清中乳酸脫氫酶、肌酸磷酸激酶、堿性磷酸酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶等活性明顯增高，致使各項(xiàng)酶指標(biāo)波動(dòng)較大，出現(xiàn)較大差異性；除此之外，動(dòng)物的采食量也將受到影響，有所下降[13]，以致動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝入不全，可能導(dǎo)致反映營(yíng)養(yǎng)狀況的各項(xiàng)指標(biāo)如白蛋白、血紅蛋白等呈現(xiàn)顯著性差異。(2)飼養(yǎng)方式不同，主要體現(xiàn)于飼料搭配方面，據(jù)報(bào)道粗料種類對(duì)大熊貓血液生化指標(biāo)影響較大[14]，如竹筍和竹葉的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，搭配不當(dāng)可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)攝入過量，堿性磷酸酶、總蛋白、總膽紅素含量升高，造成膽紅素排除受阻等；精料搭配不當(dāng)是可能造成血糖、甘油三酯等含量升高，對(duì)大熊貓?jiān)斐杉膊‰[患，應(yīng)加以重視，注意粗、精飼料合理搭配。(3)受試個(gè)體有限，本次研究受試動(dòng)物只有9只，與成都地區(qū)大熊貓個(gè)體數(shù)目相差較大。在個(gè)體數(shù)目較少的情況下，可能導(dǎo)致平均值、標(biāo)準(zhǔn)差較大，以至于參考值范圍增大，存在一定程度的誤差，但是由于重慶地區(qū)大熊貓一類野生動(dòng)物的系統(tǒng)數(shù)據(jù)較為罕見，本次研究所得結(jié)論仍具有一定的參考價(jià)值。

血液是動(dòng)物機(jī)體主要的流動(dòng)運(yùn)輸系統(tǒng)，它可以幫助完成一系列組織細(xì)胞間的物質(zhì)交換，對(duì)維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要意義。動(dòng)物血液生理生化指標(biāo)是反映動(dòng)物機(jī)體健康狀態(tài)的重要指標(biāo)，也是疾病診斷及監(jiān)控的重要評(píng)估手段。本文較系統(tǒng)地報(bào)道了重慶動(dòng)物園圈養(yǎng)大熊貓?jiān)诜锹樽頎顟B(tài)下血液正常生理生化指標(biāo)的參考范圍，有利于動(dòng)物管理者對(duì)大熊貓進(jìn)行更加準(zhǔn)確的健康評(píng)估、疾病診斷及監(jiān)控，更有助于維持和發(fā)展重慶地區(qū)圈養(yǎng)大熊貓的健康種群。

致謝：感謝重慶動(dòng)物園提供實(shí)習(xí)機(jī)會(huì)，開展本研究課題；感謝重慶動(dòng)物園每一位飼養(yǎng)員辛勤工作，對(duì)每一只受試大熊貓進(jìn)行馴化，使課題得以順利開展；感謝周俊、王曉佳提供采血技術(shù)支持；感謝西南醫(yī)院余瑤提供儀器及檢測(cè)技術(shù)支持；感謝葉兵兵、吳登虎等給予的寶貴修改意見并對(duì)文章中所有引用文獻(xiàn)作者表示由衷的感謝。