李春洪，歐明林，陳潔晶，眭維國，湯冬娥，戴 勇,※，薛 雯※

(1.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541006； 2.解放軍聯(lián)勤保障部隊第九二四醫(yī)院腎臟科 全軍器官移植與透析治療中心廣西代謝性疾病研究重點實驗室，廣西 桂林 541002； 3.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院(深圳市人民醫(yī)院)臨床醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 深圳 518020)

珠蛋白生成障礙性貧血原名地中海貧血,又稱海洋性貧血，是我國常見的常染色體隱性遺傳病，以球蛋白鏈合成障礙為主要特征，主要分布在我國廣東、廣西壯族自治區(qū)、貴州、云南等地，其中廣西壯族自治區(qū)和廣東的基因攜帶率分別達(dá)24.13%和11.07%[1-2]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球約有3.5億珠蛋白生成障礙性貧血基因攜帶者，其中α-珠蛋白生成障礙性貧血基因攜帶者2.6億，β-珠蛋白生成障礙性貧血基因攜帶者8 000萬～9 000萬，每年出生約56 000例重型珠蛋白生成障礙性貧血患兒[3]?；颊呒凹覍賹χ榈鞍咨烧系K性貧血認(rèn)識匱乏，防控難度大，生育重癥珠蛋白生成障礙性貧血患兒的風(fēng)險高，也有醫(yī)務(wù)工作者生育珠蛋白生成障礙性貧血患兒，可見重型珠蛋白生成障礙性貧血和中間型珠蛋白生成障礙性貧血是世界公認(rèn)的公共衛(wèi)生問題。珠蛋白生成障礙性貧血患兒常伴有生長發(fā)育不良而死于充血性心力衰竭[4]。目前，尚無有效的治療珠蛋白生成障礙性貧血的方法，產(chǎn)前診斷是預(yù)防該病患兒出生的唯一方法。線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)基因突變與珠蛋白生成障礙性貧血的關(guān)系是研究的熱點。線粒體損傷會直接導(dǎo)致呼吸鏈?zhǔn)軗p，從而導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生[5-8]。珠蛋白生成障礙性貧血遺傳學(xué)的研究主要集中在核基因方面，mtDNA突變可能參與珠蛋白生成障礙性貧血的發(fā)生、發(fā)展，但具體機(jī)制尚不清楚。現(xiàn)對mtDNA突變與珠蛋白生成障礙性貧血發(fā)病的關(guān)系及其機(jī)制予以綜述。

1 mtDNA基因

1.1mtDNA的結(jié)構(gòu)特征 線粒體是動態(tài)細(xì)胞器，由內(nèi)外兩層膜包被，常被稱為“細(xì)胞發(fā)電站”，以氧化磷酸方式產(chǎn)生ATP，成為能源生產(chǎn)者[9]。線粒體控制多種代謝過程，如糖酵解、檸檬酸循環(huán)、電子傳遞鏈和氧化磷酸化、尿素循環(huán)和脂肪酸生物氧化等[10]。線粒體功能對細(xì)胞的能量平衡、代謝、信號傳導(dǎo)和凋亡至關(guān)重要。人的mtDNA位于線粒體內(nèi)，是一個長度16 569 bp的環(huán)狀DNA分子，是獨立于核DNA外的遺傳物質(zhì)，由編碼氧化磷酸化所需的13種氧化磷酸作用酶亞基、合成蛋白與生成ATP必需的22種轉(zhuǎn)移RNA (transfer RNA，tRNA)、2種核糖體RNA和1個D環(huán)組成[11]。mtDNA無內(nèi)含子，D-loop區(qū)是唯一的非編碼區(qū)，該區(qū)為mtDNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，含有基因復(fù)制起點和負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的啟動子區(qū)。D-loop區(qū)是mtDNA突變集中的區(qū)域，16024～16383和57～372核苷酸分別屬第一高變區(qū)和第二高變區(qū)，分析這兩個區(qū)域基因序列可用于調(diào)查人類起源和疾病的診斷[12]。mtDNA控制區(qū)是線粒體基因組的非編碼區(qū)，又稱控制區(qū)，富含A和T堿基，屬于遺傳變異性大、進(jìn)化速度快的區(qū)域[13]。

1.2mtDNA基因的功能 mtDNA是一種結(jié)構(gòu)簡單穩(wěn)定的核外遺傳物質(zhì)，在遺傳多樣性研究中廣泛應(yīng)用。所有mtDNA編碼的多肽都參與線粒體能量的生成途徑，如與呼吸鏈有關(guān)的為復(fù)合物Ⅰ～Ⅴ均排列在線粒體內(nèi)膜內(nèi)[14]。細(xì)胞中mtDNA的拷貝數(shù)比核DNA高，具有母系遺傳、多拷貝、缺乏重組和高突變率的特點[15]。線粒體在ATP合成過程中產(chǎn)生大量活性氧類，可造成組織損傷，機(jī)制主要包括脂質(zhì)過氧化、DNA損傷、蛋白質(zhì)損傷、重要酶的氧化及促炎因子的釋放。人mtDNA不受組蛋白保護(hù)，容易發(fā)生氧化損傷，且缺乏自我修復(fù)功能[14]。線粒體基因不含內(nèi)含子，基因間間隔較小，甚至出現(xiàn)重疊基因，mtDNA在生殖細(xì)胞內(nèi)分離時，分子間無交換和重組。mtDNA的突變率比核基因高出數(shù)個數(shù)量級，且在mtDNA非編碼控制區(qū)域的兩個高變量區(qū)域(HVRⅠ和HVRⅡ)中突變率更高[16]。mtDNA非常密集，是編碼氧化磷酸化的關(guān)鍵因子，其突變母系遺傳，可導(dǎo)致多種人類線粒體疾病，同時也與年齡相關(guān)疾病和衰老密切相關(guān)[17]。線粒體蛋白由mtDNA或核DNA編碼，線粒體疾病可由兩個基因組的突變引起[9]。mtDNA的高突變率導(dǎo)致其單核苷酸多態(tài)性非常豐富。許多線粒體基因突變可導(dǎo)致基因多態(tài)性，若生殖細(xì)胞發(fā)生突變，則遺傳給子代。目前，已發(fā)現(xiàn)的線粒體單核苷酸多態(tài)性有1 321個，以轉(zhuǎn)換和顛換突變?yōu)橹?，其?82個與疾病相關(guān)。線粒體單核苷酸多態(tài)性已成為診斷線粒體疾病的重要標(biāo)志[18]。通過單核苷酸多態(tài)性與個體對藥物敏感或耐受的相關(guān)性研究，可闡明遺傳因素對藥效的影響，據(jù)此建立與基因型相關(guān)的治療方案，施行個性化用藥。

2 mtDNA基因突變與疾病的關(guān)系

mtDNA突變可對壽命和器官功能產(chǎn)生負(fù)面影響。已知有250多種致病mtDNA突變，通常涉及神經(jīng)性疾病，如目前研究較深入的阿爾茨海默病、帕金森病、2型糖尿病等[19-21]。mtDNA突變可導(dǎo)致嚴(yán)重的衰弱綜合征或死亡，其嚴(yán)重程度取決于特定的基因突變以及每個細(xì)胞和組織中突變體與野生型mtDNA的比例，美國每年出生約778例受mtDNA突變影響的兒童[22]。對24～72歲成年人皮膚成纖維細(xì)胞、血液和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中mtDNA突變的研究發(fā)現(xiàn)，mtDNA缺陷的頻率隨著年齡的增長而增加，許多突變?yōu)榉峭x突變或存在于RNA編碼基因中，可導(dǎo)致呼吸缺陷[23]。由于臨床和遺傳的異質(zhì)性，線粒體疾病的流行難以確定，其表型譜自最初發(fā)現(xiàn)經(jīng)典臨床綜合征與mtDNA重排和點突變有關(guān)以來有顯著擴(kuò)大。成人最低患病率超過1/5 000，多臨床表型和核基因組的參與使線粒體疾病對臨床醫(yī)師來說具有挑戰(zhàn)性[24-25]。

mtDNA缺陷是線粒體疾病的主要遺傳原因，核DNA編碼的線粒體相關(guān)基因缺陷也可導(dǎo)致線粒體疾病的遺傳，已在mtDNA中發(fā)現(xiàn)了許多引起各種類型線粒體疾病的致病突變[26]。致病mtDNA突變通常具有異質(zhì)性，由野生型和突變型mtDNA基因組共同組成，其異質(zhì)水平與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[27]。最常見的致病突變是MTTL1基因(OMIM590050)中mtDNA的3243A→G突變(m.3243A→G)，編碼tRNALeu(UUR)引起線粒體疾病和生理功能障礙，如線粒體腦病、乳酸癥、腦卒中樣發(fā)作和線粒體肌病等[28-29]。探究摩洛哥2型糖尿病患者的mtDNA變異和單倍群的相關(guān)性試驗研究發(fā)現(xiàn)，疾病組中5種mtDNA突變體(C16187T、C16270T、T16172C、A16293G和C16320T)的流行性明顯高于對照組，C16270T和C16320T變異與摩洛哥2型糖尿病患病風(fēng)險增加密切相關(guān)[30]。在腫瘤發(fā)生方面，誘導(dǎo)活性氧類的特異性mtDNA突變增強(qiáng)了肺癌細(xì)胞向高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。Mohamed Yusoff等[31]對49例腦腫瘤患者的腫瘤組織和血樣進(jìn)行基因突變分析，對D-loop區(qū)未被識別的新突變(176 A缺失，476C→A,566C→A和16405A缺失)進(jìn)行分類，為馬來西亞患者腦腫瘤中mtDNA的D-loop區(qū)域的改變提供了證據(jù)。D-loop啟動子CpG島特異性位點的去甲基化可能導(dǎo)致結(jié)直腸癌mtDNA拷貝數(shù)升高，引發(fā)細(xì)胞增殖增加、凋亡減少、G0/G1期相對細(xì)胞周期阻滯等生物學(xué)行為的改變[32]。有研究發(fā)現(xiàn)，mtDNA突變引起的線粒體功能障礙是多囊卵巢綜合征的重要原因，線粒體tRNA突變與一組漢族家庭的代謝綜合征和多囊卵巢綜合征相關(guān)，其tRNALeu(UUR)C3275T、tRNAGlnT4363C和tRNALysA8343G突變應(yīng)被視為其代謝綜合征和多囊卵巢綜合征進(jìn)一步分子診斷的危險因素[33]。Wei等[34]對1 363例帕金森病、阿爾茨海默病、額顳葉癡呆-肌萎縮側(cè)索硬化癥、克雅病與正常對照腦組織進(jìn)行全基因組測序發(fā)現(xiàn)，32.3%的受試者出現(xiàn)異常高頻率的異質(zhì)mtDNA變異，但并未發(fā)現(xiàn)任何罕見mtDNA或mtDNA異質(zhì)性與疾病存在聯(lián)系的證據(jù)；此外，觀察到阿爾茨海默病和克雅病中mtDNA拷貝減少，可見mtDNA水平的變化在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用，但mtDNA單核苷酸變異并不太可能在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制中起主要作用，其mtDNA水平尚待進(jìn)一步研究。

3 mtDNA基因突變與珠蛋白生成障礙性貧血發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性

3.1α-珠蛋白生成障礙性貧血的分子機(jī)制 珠蛋白生成障礙性貧血是一種常染色體隱性遺傳病，與至少一種珠蛋白基因突變/缺失導(dǎo)致功能性血紅蛋白減少有關(guān)[35]。國內(nèi)外科研工作者對珠蛋白生成障礙性貧血核基因缺陷和突變方面發(fā)病機(jī)制的研究比較深入。根據(jù)基因分型，臨床上將珠蛋白生成障礙性貧血分為α型、β型、αβ型、γ型及δ型等，其中α型和β型高發(fā)。α-珠蛋白生成障礙性貧血是最常見的單基因疾病，主要由α-珠蛋白基因表達(dá)缺失或減少導(dǎo)致，其基因位于第16號染色體短臂13區(qū)3帶(16p13.3)，每條染色體上均有兩個α-珠蛋白基因，其排列順序為5′-ε-Gγ-Aγ-ψβ-δ-β-3′，且HS-40是α-珠蛋白位點的主要調(diào)控元件[36]。根據(jù)α-珠蛋白基因簇的缺失，α-珠蛋白生成障礙性貧血可分為：①輕型，2個α位點缺失；②中間型，即血紅蛋白H病，受影響個體產(chǎn)生的α-珠蛋白通常不到正常水平的30%，而β-珠蛋白相對過量；③重型，即Hb Bart胎兒水腫綜合征，為4個α位點缺失,此類患者通常在子宮內(nèi)或出生后不久死亡[37]。據(jù)統(tǒng)計，全球α-珠蛋白生成障礙性貧血攜帶者高達(dá)5.0%，其中1.7%有α-珠蛋白生成障礙性貧血癥狀，新生兒珠蛋白生成障礙性貧血的發(fā)病率約為 4.4/1萬[38]。

3.2β-珠蛋白生成障礙性貧血的分子機(jī)制 β-珠蛋白生成障礙性貧血為單基因疾病，是全世界最普遍的常染色體隱性疾病，特點是功能性β-球蛋白鏈減少,α-肽鏈相對過剩并在紅細(xì)胞膜上沉積，導(dǎo)致紅細(xì)胞破壞，出現(xiàn)溶血性貧血,其失衡程度與疾病嚴(yán)重程度成正比[39]。β-珠蛋白生成障礙性貧血基因位于第11號染色體短臂1區(qū)2帶(11p1.2)，每條染色體上只有一個β-珠蛋白基因，排列順序為5′-ε-Gγ-Aγ-ψβ-δ-β-3′，且位點控制區(qū)是上游重要的調(diào)控區(qū)域[40]。α-球蛋白鏈和β-球蛋白鏈比例失衡和α肽鏈的不必要積累造成機(jī)械和氧化損傷，導(dǎo)致無效紅細(xì)胞生成，與疾病嚴(yán)重程度直接相關(guān)。重型β-珠蛋白生成障礙性貧血是β-珠蛋白生成障礙性貧血的嚴(yán)重形式，其病理生理學(xué)以及隨后定期輸血導(dǎo)致鐵超載，逐漸累及多個器官系統(tǒng)[41]。β-珠蛋白生成障礙性貧血的突變類型多為點突變，而β-珠蛋白基因外顯子中只有少數(shù)缺失，如βCD54～58(-13 bp)和βCD89～93(-14 bp)。根據(jù)β-球蛋白鏈合成量降低程度，β-珠蛋白生成障礙性貧血突變可分為：①β0-珠蛋白生成障礙性貧血突變(β0/)，導(dǎo)致β-珠蛋白的缺失；②β+-珠蛋白生成障礙性貧血突變(β+/)，導(dǎo)致β-珠蛋白產(chǎn)量嚴(yán)重減少；β++-珠蛋白生成障礙性貧血突變(β++/)，導(dǎo)致β-珠蛋白的產(chǎn)量輕微減少[40]。目前，β-珠蛋白生成障礙性貧血突變至少有200種，中國人至少有34種。世界范圍內(nèi)，貧血導(dǎo)致的疾病負(fù)擔(dān)在很大程度上成為很多疾病發(fā)病率和死亡率升高的原因[42]。組織缺氧，心臟病發(fā)病是β-珠蛋白生成障礙性貧血病死率升高的主要原因。臨床上，珠蛋白生成障礙性貧血患者表現(xiàn)為慢性進(jìn)行性溶血性貧血，臨床癥狀差異大，人們著重關(guān)注與研究珠蛋白生成障礙性貧血臨床異質(zhì)性的相關(guān)因素，如順式作用因子、DNA甲基化、組蛋白乙?；?、微RNA等。β-珠蛋白生成障礙性貧血患者表型嚴(yán)重程度主要由β-珠蛋白的基因型決定，但一些基因修飾因子(如α-珠蛋白和KLF1基因)在表型調(diào)節(jié)中也發(fā)揮作用。珠蛋白生成障礙性貧血常通過頻繁的紅細(xì)胞輸血來治療，引起鐵過載，鐵催化活性氧類生成，而過量活性氧類有毒，對心臟、肝臟和內(nèi)分泌系統(tǒng)等重要器官造成損害，破壞紅細(xì)胞細(xì)胞膜，使紅細(xì)胞運輸氧的能力下降，導(dǎo)致mtDNA結(jié)構(gòu)受損，線粒體功能障礙[43]。

3.3mtDNA基因突變與紅細(xì)胞和血紅蛋白的相關(guān)性 線粒體可產(chǎn)生能量，并生成細(xì)胞內(nèi)活性氧類，過量生成的細(xì)胞內(nèi)活性氧類和氧化還原體系失衡均會導(dǎo)致機(jī)體氧化損傷，紅細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，膜蛋白構(gòu)象變化，蛋白交聯(lián)，脂質(zhì)過氧化，釋放血紅蛋白，從而導(dǎo)致紅細(xì)胞溶血。mtDNA結(jié)構(gòu)破壞和功能紊亂也會導(dǎo)致紅細(xì)胞發(fā)育異?；蚓抻准?xì)胞性貧血，細(xì)胞中氧化損傷開始積累[44-45]。游離球蛋白鏈和不穩(wěn)定血漿鐵生成的細(xì)胞內(nèi)活性氧類是珠蛋白生成障礙性貧血患者紅細(xì)胞中活性氧類的主要來源?；钚匝躅惖难趸瘬p傷被認(rèn)為是細(xì)胞損傷、組織損傷和珠蛋白生成障礙性貧血患者血液高凝的主要原因之一[46]。在紅細(xì)胞中，氧化損傷可將磷脂磷脂酰絲氨酸隔離到細(xì)胞膜內(nèi)層單細(xì)胞，削弱轉(zhuǎn)位酶的活性。紅細(xì)胞表面暴露的磷脂磷脂酰絲氨酸可作為脾臟巨噬細(xì)胞捕獲和破壞成熟紅細(xì)胞的信號，從而導(dǎo)致貧血[47]。mtDNA突變的增加可延遲線粒體清除，增加游離鐵、紅細(xì)胞脂質(zhì)氧化和膜修飾等延緩紅細(xì)胞的成熟，并在脾臟加速破壞，縮短紅細(xì)胞的壽命。造血祖細(xì)胞對mtDNA突變具有特殊的敏感性，可見mtDNA突變的增加可能是貧血的基礎(chǔ)[47]?；钚匝躅愃缴咭矔?dǎo)致細(xì)胞毒性和器官功能受損，如心臟、肝臟和大腦。無細(xì)胞血紅蛋白是血管內(nèi)溶血的顯著標(biāo)志，最終被氧化為高鐵血紅蛋白。實驗研究表明，高鐵血紅蛋白可對血小板產(chǎn)生氧化應(yīng)激，而非血紅蛋白，并通過活性氧類介導(dǎo)的線粒體凋亡通路觸發(fā)血小板死亡[48]。鐵過載對珠蛋白生成障礙性貧血的發(fā)病起重要作用。在鐵過載條件下，多余的鐵參與非轉(zhuǎn)鐵鐵循環(huán)，催化芬頓反應(yīng)生成羥自由基，導(dǎo)致氧化應(yīng)激。自由基直接導(dǎo)致DNA和其他生物分子(如脂質(zhì)和蛋白質(zhì))發(fā)生氧化反應(yīng)。脂質(zhì)過氧化副產(chǎn)物可與DNA直接反應(yīng)形成DNA內(nèi)收物，影響珠蛋白的表達(dá)[49]。

3.4mtDNA基因突變與珠蛋白生成障礙性貧血發(fā)生發(fā)展的關(guān)系 遺傳性線粒體疾病由mtDNA或編碼線粒體蛋白的核DNA基因缺陷引起，可影響氧化磷酸化復(fù)合物、mtDNA翻譯和維護(hù)、線粒體組裝蛋白和線粒體膜組成的亞基[50]。對35例β-珠蛋白生成障礙性貧血患者進(jìn)行mtDNA的D-loop多態(tài)性檢測研究發(fā)現(xiàn)，與504例正常對照組比較，mtDNA的D-loop核苷酸多態(tài)性16069C>T、16189T>C、16319G>A、16519T>C的差異有統(tǒng)計學(xué)意義[51]。α-珠蛋白生成障礙性貧血患者線粒體D-loop的序列也呈現(xiàn)出相似的遺傳多樣性[52]。有研究報道了β-珠蛋白生成障礙性貧血患者線粒體膜通透性的改變，mtDNA受損，還發(fā)現(xiàn)不同藥物干預(yù)下，β-珠蛋白生成障礙性貧血患者線粒體功能障礙的情況[53]。有研究表明，β0-珠蛋白生成障礙性貧血/血紅蛋白E病患者與正常對照組的有核紅細(xì)胞線粒體熒光染色存在顯著差異，其線粒體數(shù)量在第10天出現(xiàn)顯著增多，球蛋白鏈合成障礙，線粒體損傷與無效紅細(xì)胞生成同時發(fā)生，表明未配對球蛋白鏈的沉積可能直接影響線粒體的完整性[54]。因此，mtDNA的基因多態(tài)性可使珠蛋白生成障礙性貧血基因型與表型之間的相關(guān)性復(fù)雜化。

4 小 結(jié)

mtDNA突變在珠蛋白生成障礙性貧血發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。目前，國內(nèi)外對線粒體基因突變與珠蛋白生成障礙性貧血發(fā)病機(jī)制間的相關(guān)性研究較少，且機(jī)制尚不完全清楚。深入探究珠蛋白生成障礙性貧血mtDNA突變的相關(guān)生物學(xué)信息，尋找生物標(biāo)志物，將為珠蛋白生成障礙性貧血的研究提供新的理論和實驗基礎(chǔ)，為珠蛋白生成障礙性貧血的治療提供新的靶點，為臨床上防治珠蛋白生成障礙性貧血提供新途徑，綜合服務(wù)于優(yōu)生優(yōu)育，并可結(jié)合我國豐富的中藥材資源，積極尋找新的藥物靶位點。