況成裕，張清華，郭小藤，崔 燕

（山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250101）

金剛藤為百合科植物菝葜（Smilax chinaL.）的根莖，又名金剛刺、假萆解[1]，分布于我國(guó)陜西、甘肅、湖北、四川、貴州及西藏等地區(qū)。其性甘溫?zé)o毒，有清熱解毒、消腫散結(jié)之功效。歷代本草多用其根莖入藥，其莖和葉未見(jiàn)使用。每年8～10月采收后，大量的莖和葉被拋棄。

因金剛藤的主要活性物質(zhì)是黃酮，黃酮類(lèi)化合物生物活性眾多，經(jīng)提取分離純化，可充分應(yīng)用于醫(yī)藥工業(yè)。近年，國(guó)內(nèi)外學(xué)者從金剛藤中發(fā)現(xiàn)一系列具有生物活性的化學(xué)成分[2-3]：落新婦苷、山萘酚、山萘酚-7-O-β-D-吡喃葡糖苷、黃杞苷、異鼠李素、槲皮素3-O-α-L-鼠李糖苷、槲皮素、新異落新婦苷、二氫山萘酚、槲皮素-3-O-葡糖苷等多種黃酮類(lèi)化合物，具有心血管活性、免疫抑制、減輕腎功能損傷、保肝等作用[4-7]，其中落新婦苷含量較高[8]，且生物活性較強(qiáng)，具有有效降低腎臟損傷、抗炎、免疫抑制、抑制排異反應(yīng)、保護(hù)肝臟等作用[9-10]。本文通過(guò)采用紫外分光光度法（UV）和高效液相色譜法（HPLC），對(duì)金剛藤及菝葜莖、葉中的總黃酮含量及落新婦苷含量進(jìn)行了對(duì)比研究，為菝葜在醫(yī)藥工業(yè)方面的開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

8453型紫外-可見(jiàn)分光光度儀（Agilent公司）；Waters 2695高效液相色譜儀（Waters公司）；XP205電子分析天平（梅特勒-托利多公司）；KQ2200DA型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器公司）。

1.2 試藥

菝葜于2015年8～9月和2018年9～10月采集于貴州開(kāi)陽(yáng)縣、修文縣和四川安岳縣，經(jīng)鑒定為百合科植物菝葜（Smilax chinaL.），將其根、莖、葉分別洗凈、切片、曬干，其根即為金剛藤，莖、葉即為菝葜莖、葉；落新婦苷對(duì)照品（自制，含量97.82 %）；乙醇為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 取105 ℃干燥至恒重的落新婦苷對(duì)照品（含量為97.82 %）約10 mg，精密稱定（10.30 mg），置入100 ml量瓶，加乙醇約50 ml，超聲使溶解，加乙醇至刻度，搖勻，制成濃度為0.101 mg/ml對(duì)照品溶液[11-12]。

2.1.2 供試品溶液的制備 取金剛藤、菝葜莖、菝葜葉細(xì)粉各約0.3 g，精密稱定，分別置250 ml圓底燒瓶中，精密加入乙醇100 ml，稱定重量，水浴回流提取1 h，放冷，再稱定重量，用乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為金剛藤、菝葜莖、菝葜葉供試品溶液。

2.1.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 精密量取對(duì)照品溶液與金剛藤、菝葜莖、菝葜葉供試品溶液各1 ml，分別置10 ml量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻；以乙醇為空白，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，對(duì)照品溶液與金剛藤、菝葜莖、菝葜葉供試品溶液均在292 nm處有最大吸收峰（見(jiàn)圖1），因此選擇292 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)[13-14]。

圖1 紫外掃描圖譜

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取對(duì)照品溶液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 ml，分別置10 ml量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻；以乙醇為空白，在292 nm處測(cè)定吸光度，以濃度（C，μg/ml）為橫坐標(biāo)，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A=41.27C+0.063（r=0.9993）。結(jié)果表明，落新婦苷在0～30.6 μg/ml濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密量取對(duì)照品溶液、金剛藤、菝葜莖、菝葜葉供試品溶液各5 ml，分別置50 ml量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，連續(xù)測(cè)定6次吸光度。結(jié)果RSD分別為0.413 %（n=6）、0.317 %（n=6）、0.508 %（n=6）、0.643 %（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取對(duì)照品溶液、金剛藤、菝葜莖、菝葜葉供試品溶液各5 ml，分別置50 ml量瓶，加乙醇至刻度，搖勻，于配置后每隔60 min測(cè)定吸光度，共7次，RSD分別為1.97 %（n=7）、2.33 %（n=7）、1.88 %（n=7）、2.57 %（n=7）。結(jié)果表明，對(duì)照品溶液、供試品溶液在360 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取金剛藤、菝葜莖、菝葜葉細(xì)粉各約0.3 g，共6份，精密稱定，分別置250 ml圓底燒瓶中，精密加入乙醇100 ml，稱定重量，水浴回流提取1 h，放冷，再稱定重量，用乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液1 ml，分別置10 ml量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻；以乙醇為空白，在292 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，RSD分別為2.77 %（n=6）、3.13 %（n=6）、3.54 %（n=6）。

2.1.8 回收率試驗(yàn) 取落新婦苷對(duì)照品（含量為97.82 %）約50 mg，精密稱定（52.48 mg），置50 ml量瓶中，加乙醇約30 ml，超聲使溶解，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為1.03 mg/ml溶液。取已知總黃酮含量的金剛藤、菝葜莖、菝葜葉細(xì)粉（總黃酮含量分別為51.23，43.22，18.12 mg/g）約0.2 g，各5份，精密稱定，分別精密加入落新婦苷對(duì)照品溶液（濃度為1.03 mg/ml）5 ml，按2.1.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，測(cè)定吸光度值并計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 總黃酮回收率結(jié)果

2.1.9 樣品含量測(cè)定 取不同產(chǎn)地金剛藤及菝葜莖、葉各7批，按2.1.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，測(cè)定吸光度值并計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

2.2 落新婦苷含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Waters Spherisorb CNRP（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙醇-0.1 %冰乙酸溶液（39:61）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：291 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取105 ℃干燥至恒重的落新婦苷對(duì)照品51.72 mg（含量為97.82 %），置50 ml量瓶中，用乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得1.01 mg/ml的落新婦苷對(duì)照品貯備液；精密量取5 ml，置10 ml量瓶中，用乙醇稀釋至刻度，搖勻，制得0.505 mg/ml的落新婦苷對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取金剛藤、菝葜莖、菝葜葉細(xì)粉各約0.5 g，精密稱定，分別置于50 ml具塞錐形瓶中，精密加入60 %乙醇30 ml，密塞，稱定重量，靜置30 min，搖勻，超聲提取（40 kW，100 Hz）3 min，放冷，再稱定重量，用60 %乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取對(duì)照品溶液和金剛藤、菝葜莖、菝葜葉供試品溶液各20 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見(jiàn)圖2。供試品溶液的色譜圖中，在與對(duì)照品溶液色譜圖相應(yīng)的位置上，有相同保留時(shí)間的色譜峰，且主峰與雜質(zhì)峰的分離良好。

圖2 HPLC色譜圖

2.2.5 線性關(guān)系考察 分別精密量取落新婦苷對(duì)照品貯備液0，0.6，1.2，1.8，2.4，3.0 ml，置100 ml量瓶中，用乙醇稀釋至刻度，搖勻，分別制得0，6.06，12.12， 18.18，24.24，30.30 μg/ml的樣品溶液，按2.2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程及線性范圍：Y=87 785X+37 657（r=0.9994），結(jié)果表明，落新婦苷進(jìn)樣量在0～0.606 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密量取落新婦苷對(duì)照品溶液20 μl，按2.2.1項(xiàng)色譜條件重復(fù)測(cè)定6次，測(cè)得落新婦苷峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.93 %，表明該方法有良好的系統(tǒng)精密度。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取落新婦苷對(duì)照品溶液，金剛藤、菝葜莖、菝葜葉供試品溶液20 μl，按2.2.1項(xiàng)色譜條件，每隔60 min測(cè)定吸光度，各7次。結(jié)果表明，供試品溶液在360 min內(nèi)基本穩(wěn)定，RSD為2.33 %（n=7）、2.37 %（n=7）、1.87 %（n=7）、2.11 %（n=7）。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取金剛藤、菝葜莖、菝葜葉細(xì)粉各約0.5 g，共6份，分別置于50 ml具塞錐形瓶中，精密加入60 %乙醇30 ml，密塞，稱定重量，靜置30 min，搖勻，超聲提?。?0 kW，100 Hz）30 min，放冷，再稱定重量，用60 %乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定吸光度，RSD為3.14 %（n=6）、2.67 %（n=6）、2.44 %（n=6）。

2.2.9 回收率試驗(yàn) 取落新婦苷對(duì)照品（含量為97.82 %）50 mg，精密稱定（51.51 mg），置50 ml量瓶中，加乙醇約30 ml，超聲使溶解，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為1.01 mg/mL溶液。

取已知落新婦苷含量的金剛藤、菝葜莖、菝葜葉樣品（落新婦苷含量分別為4.87，3.97，1.03 mg/g）約0.2 g，各5份，精密稱定，分別精密加入落新婦苷對(duì)照品溶液（濃度為1.01 mg/ml）2 mL，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照2.2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 落新婦苷回收率結(jié)果

2.2.10 樣品含量測(cè)定 取不同產(chǎn)地金剛藤及菝葜莖、葉各7批，按2.2.3項(xiàng)方法制備供試品溶液，照2.2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

近年，關(guān)于金剛藤（菝葜根莖）及金剛藤總黃酮提取物的研究越來(lái)越多，大部分集中于金剛藤，對(duì)菝葜莖、葉的研究很少。菝葜中不同部位黃酮化合物的含量比較也未見(jiàn)報(bào)道。本研究比較了金剛藤、菝葜莖、菝葜葉中的總黃酮含量，并證明了落新婦苷是金剛藤中黃酮的指標(biāo)性成分。結(jié)果表明，金剛藤中總黃酮含量為49.87～56.33 mg/g，落新婦苷含量為4.67～5.12 mg/g；菝葜莖中總黃酮含量為40.99～48.56 mg/g，落新婦苷含量為3.67～4.14 mg/g；菝葜葉中總黃酮含量為14.85～22.34 mg/g，落新婦苷含量為0.98～1.32 mg/g。菝葜不同部位的總黃酮含量存在較大差異，菝葜莖、葉可以用于提取分離制備總黃酮，但不可替代金剛藤作為藥品使用。