高新貞，劉 枕，王 穎，王彥厚

（淄博市食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 淄博 255086）

中藥飲片是介于農(nóng)產(chǎn)品和藥品之間的產(chǎn)品[1]，有些品種既是生產(chǎn)中成藥的原料，又可經(jīng)簡(jiǎn)單處理用于患者，還可作為食品用于日常生活，稱為藥食兩用中藥飲片。近年，如枸杞、菊花、黑芝麻、山楂，及價(jià)格相對(duì)昂貴的阿膠、人參均作為藥食兩用中藥飲片，使用量與日俱增。但這類飲片若被微生物污染，會(huì)產(chǎn)生很多不良影響：一方面表現(xiàn)在微生物中的致病菌和條件致病菌對(duì)人體健康有直接威脅；另一方面，被微生物污染的藥品，其理化性質(zhì)改變會(huì)降低藥品的有效性，甚至某些被微生物和酶降解的產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致使用者產(chǎn)生不良反應(yīng)，甚至死亡[2]。另外在實(shí)際生活中，大多數(shù)服用者對(duì)微生物缺乏了解，對(duì)服用被微生物污染的飲片后身體產(chǎn)生的不良反應(yīng)與飲片微生物污染的相關(guān)性知之甚少，更無(wú)從論證與考察。因此制定合理的飲片微生物檢查標(biāo)準(zhǔn)，有效控制其質(zhì)量，使其真正起到保健養(yǎng)生、食為藥用的功能至關(guān)重要。為此筆者從醫(yī)院、藥店、超市、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)分別隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)了27批常用藥食兩用中藥飲片，先按《中國(guó)藥典》要求進(jìn)行符合性檢驗(yàn)，然后參考《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)》相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢查需氧菌總數(shù)和控制菌，考察飲片的污染現(xiàn)狀，為下一步合理制定標(biāo)準(zhǔn)、控制質(zhì)量提供參考依據(jù)。同時(shí)通過(guò)比較不同來(lái)源、不同包裝的同品種中藥飲片的微生物污染狀況，闡述包裝、儲(chǔ)存、運(yùn)輸?shù)闹匾浴?/p>

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

分別從醫(yī)院、藥店、超市、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)枸杞、薄荷、金銀花、蒲公英、菊花共25份散裝樣品；從超市購(gòu)買(mǎi)單劑量包裝的枸杞、菊花各1份樣品，包裝標(biāo)示飲用方法為95 ℃以上熱水沖泡3～5 min。以A、B、C、D、E分別表示枸杞、薄荷、金銀花、蒲公英、菊花；以阿拉伯?dāng)?shù)字表示購(gòu)買(mǎi)來(lái)源，分別為1淄博市張店區(qū)某藥店、2淄博市周村區(qū)某超市、3淄博市周村區(qū)某醫(yī)院、4淄博市張店區(qū)某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、5淄博市周村區(qū)某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、6淄博市張店區(qū)某超市。

1.2 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號(hào)：1065575）；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：3304006）；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：3303050）；紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：3304009）；麥康凱液體培養(yǎng)基（批號(hào)：3304008）；pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號(hào)：3104094）。上述培養(yǎng)基購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，已進(jìn)行適用性檢查，均符合規(guī)定。

腸道菌增菌液體培養(yǎng)基（批號(hào)：150804）；RV沙門(mén)菌增菌液體培養(yǎng)基（批號(hào)：150914）；甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：150806）；溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基（150801）；木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：150916）；三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：151117）；MUG培養(yǎng)基（批號(hào)：150128）。上述培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司，已進(jìn)行適用性檢查，均符合規(guī)定。

1.3 試劑

沙門(mén)菌干制生化鑒定試劑盒（批號(hào)：170914）；大腸埃希菌干制生化鑒定試劑盒（批號(hào)：170712）；凍干血漿（批號(hào)：171025）；色氨酸肉湯（批號(hào)：170801）。上述試劑均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.4 菌種及菌液制備

接種銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10 104]、大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44 102]、乙型副傷寒沙門(mén)菌(Salmonella paratyphiB)[CMCC(B)50 094]的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，33 ℃培養(yǎng)24 h。取上述新鮮培養(yǎng)物1 ml，用pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液10倍稀釋至小于100 cfu/ml，備用。上述菌種均由山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院提供。

1.5 儀器

BPX-162電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海博訊）；LRHS-150-Ⅱ恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)）；MJX-250B-Z霉菌培養(yǎng)箱（上海博訊）；GHP-9160N隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒）；YXQ-LS-70A全自動(dòng)立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊）；HC-B10001電子天平（慈溪華徐衡器）；HR40-ⅡB2生物安全柜（青島海爾）；Vitek2 compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)（法國(guó)梅里埃）；奧林巴斯CX31生物顯微鏡 （日本奧林巴斯）；ZF-2三用紫外儀（上海安亭）。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥典符合性檢驗(yàn)

根據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版四部[3]通則1106、1107的規(guī)定進(jìn)行試驗(yàn)，考察中藥飲片質(zhì)量是否符合《中國(guó)藥典》要求。

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn) 按照通則1107非無(wú)菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)表4對(duì)研粉口服用貴細(xì)飲片、直接口服及泡服飲片的規(guī)定，上述飲片可歸類為直接泡服的中藥飲片，應(yīng)不得檢出沙門(mén)菌（10 g）；耐膽鹽革蘭陰性菌應(yīng)小于104cfu（1 g）。

2.1.2 試驗(yàn)方法 按通則1106非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法進(jìn)行檢查。

2.1.2.1 耐膽鹽革蘭陰性菌檢查 供試液制備和預(yù)培養(yǎng) 取供試品10 g，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至100 ml，混勻，作為1:10供試液，23 ℃培養(yǎng)2 h，用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基作為稀釋劑10倍梯度稀釋，分別制成1:100、1:1000和1:10000供試液。

選擇和分離培養(yǎng) 取經(jīng)預(yù)培養(yǎng)后的1:10、1:100、1:1000、1:10000供試液各1 ml分別接種至10 ml腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，33 ℃培養(yǎng)24～48 h，上述每一培養(yǎng)物分別劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，33 ℃培養(yǎng)18～24 h。

結(jié)果判斷 若紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長(zhǎng)，則對(duì)應(yīng)培養(yǎng)管為“+”，否則為“-”。根據(jù)各培養(yǎng)管檢查結(jié)果，從通則1106表2查1 g供試品中含有耐膽鹽革蘭陰性菌的可能菌數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)27批次樣品的耐膽鹽革蘭陰性菌定量試驗(yàn)中，有24批次樣品紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)，耐膽鹽革蘭陰性菌小于10 cfu/g；有3批次大于104cfu/g，分別為來(lái)源于兩家農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的枸杞和一家藥店的菊花。

表1 耐膽鹽革蘭陰性菌檢查結(jié)果

2.1.2.2 沙門(mén)菌檢查 供試液制備和增菌培養(yǎng) 取供試品10 g接種至200 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，33 ℃培養(yǎng)18～24 h。

選擇和分離培養(yǎng) 取上述培養(yǎng)物0.1 ml接種至10 mRV沙門(mén)菌增菌液體培養(yǎng)基中，33 ℃培養(yǎng)18～24 h；取少量RV沙門(mén)菌增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（XLD）平板上，33 ℃培養(yǎng)18～48 h；用接種針挑選疑似菌落于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進(jìn)行斜面和高層穿刺接種，33℃培養(yǎng)18～24h，或采用其他適宜方法進(jìn)一步鑒定。

結(jié)果判斷 按照通則1106相關(guān)要求進(jìn)行。結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可見(jiàn)，27批樣品在XLD平板上均有菌落生長(zhǎng)，經(jīng)初步生化鑒定均為非沙門(mén)菌。對(duì)菌落形態(tài)一致的21批樣品再次分離純化，進(jìn)行儀器鑒定，結(jié)果97 %概率為泛菌屬。其余6批因試劑不足，未進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

表2 沙門(mén)菌檢查結(jié)果

2.2 增項(xiàng)檢查

按同類食品要求增加檢查項(xiàng)目，并進(jìn)行質(zhì)量考察和研究?？紤]到藥食兩用中藥飲片常用于制作糕點(diǎn)、飲品、冷食菜等，筆者參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)》中的 GB/T 4789.21-2003[4]、GB/T 4789.23-2003[5]及GB/T 4789.24-2003[6]3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)冷食菜、糕點(diǎn)、蜜餞、飲料等食品均有菌落總數(shù)、大腸菌群、沙門(mén)菌、志賀菌、金黃色葡萄球菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)的檢驗(yàn)要求。藥典已規(guī)定了沙門(mén)菌、耐膽鹽革蘭陰性菌檢查，考慮到大腸埃希菌為口服制劑必檢項(xiàng)目，結(jié)合現(xiàn)有試驗(yàn)條件，選擇菌落總數(shù)、大腸埃希菌和分布廣泛的金黃色葡萄球菌3個(gè)項(xiàng)目對(duì)中藥飲片進(jìn)行檢查，并將菌落總數(shù)統(tǒng)一到藥典術(shù)語(yǔ)：需氧菌總數(shù)。為模擬藥食兩用中藥飲片在服用時(shí)進(jìn)行沸水沖泡的過(guò)程，筆者選取了市場(chǎng)需求量大的枸杞和菊花共計(jì)12批次，95 ℃水浴處理10 min前后，分別對(duì)其進(jìn)行需氧菌總數(shù)、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌檢查。

2.2.1 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法 取樣品25 g，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基225 ml，45 ℃保溫振搖混勻，作為1:10供試液。10倍梯度稀釋制成1:100、1:1000、1:10000的供試液。參考2.1項(xiàng)結(jié)果可見(jiàn)，樣品污染較嚴(yán)重，因此樣品處理前計(jì)數(shù)試驗(yàn)從1:100做起，處理后計(jì)數(shù)試驗(yàn)從1:10做起。采用平皿法中的傾注法，計(jì)數(shù)結(jié)果保留兩位有效數(shù)字，平板上若無(wú)菌落生長(zhǎng)，以＜1乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告。結(jié)果見(jiàn)表3、表4。

2.2.2 大腸埃希菌檢查方法 取1:10供試液10 ml接種至100 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，混勻，33 ℃培養(yǎng)24 h；取上述培養(yǎng)物1 ml接種至100 ml麥康凱液體培養(yǎng)基，43 ℃培養(yǎng)48 h；取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，33 ℃培養(yǎng)72 h，選取典型菌落進(jìn)行分離、純化、染色鏡檢。結(jié)果見(jiàn)表3、表4。

2.2.3 金黃色葡萄球菌檢查方法 取1:10供試液10 ml接種至100 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，33 ℃培養(yǎng)24 h；取上述培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，33 ℃培養(yǎng)72 h，選取典型菌落進(jìn)行分離、純化、鑒定。結(jié)果見(jiàn)表3、表4。

表3 樣品處理前需氧菌總數(shù)、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌檢查結(jié)果

表4 樣品處理后需氧菌總數(shù)、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌檢查結(jié)果

3 討論

按《中國(guó)藥典》2015年版四部[3]通則1106、1107的相關(guān)要求進(jìn)行符合性檢驗(yàn)，27批樣品中有3批耐膽鹽革蘭陰性菌超標(biāo)，不合格率達(dá)11.1 %。有文獻(xiàn)[7]報(bào)道，相對(duì)安全的微生物指標(biāo)，空氣中的微生物濃度為1～104cfu/L；水中的微生物濃度為1～104cfu/ml；生活飲用水100 cfu/ml。由表3可見(jiàn)，處理前有1批枸杞達(dá)到106cfu/g，2批枸杞、2批菊花接近105cfu/g，均超過(guò)上述指標(biāo)，且接近《美國(guó)藥典》38版對(duì)使用前用沸水處理的植物中需氧菌總數(shù)≤105cfu/g限度標(biāo)準(zhǔn)[2]。由此可見(jiàn)，藥食兩用中藥飲片微生物污染現(xiàn)狀不容樂(lè)觀，建議加強(qiáng)對(duì)藥食兩用中藥飲片的微生物檢驗(yàn)。

27批樣品均未檢出沙門(mén)菌，符合現(xiàn)行藥典的相關(guān)規(guī)定。但在XLD平板上生長(zhǎng)的菌落經(jīng)分離、純化、鑒定，多為泛菌屬。泛菌屬為條件致病菌，服用人群不同，如新生兒、嬰幼兒及體弱者，致病風(fēng)險(xiǎn)可能不同[3]。1批購(gòu)自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的枸杞，樣品編號(hào)A-4，經(jīng)處理后在EMB平板上仍有菌落生長(zhǎng)，經(jīng)染色鏡檢確定為革蘭陽(yáng)性芽孢菌。此類菌耐熱性高，尤其對(duì)體弱者致病性強(qiáng)，應(yīng)嚴(yán)格控制?！睹绹?guó)藥典》、《歐洲藥典》、《日本藥局方》中對(duì)類似于中國(guó)的中藥飲片的藥品，均規(guī)定了需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)、大腸埃希菌的檢查[2]。因此現(xiàn)行《中國(guó)藥典》對(duì)中藥飲品的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)不足以排除其潛在風(fēng)險(xiǎn)，建議對(duì)中藥飲片增加微生物檢驗(yàn)項(xiàng)目。

由表4可見(jiàn)，經(jīng)處理后的樣品需氧菌總數(shù)大大降低，下降2～4個(gè)數(shù)量級(jí)，僅有3批達(dá)到102cfu/g，處于相對(duì)安全的水平。另外，樣品處理前，2批檢出金黃色葡萄球菌，2批檢出大腸埃希菌。樣品經(jīng)處理后，均未檢出相應(yīng)控制菌。因此中藥飲片在無(wú)特殊服用要求時(shí)，建議盡量熱水泡服或經(jīng)過(guò)其它加熱方式處理，能有效殺滅微生物，降低服用風(fēng)險(xiǎn)。

微生物生長(zhǎng)的條件是營(yíng)養(yǎng)、空氣、水分等。由結(jié)果可見(jiàn)，2批單劑量包裝的中藥飲片，處理前后，計(jì)數(shù)平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)；控制菌檢查無(wú)論是藥典規(guī)定項(xiàng)目，還是筆者增加的檢查項(xiàng)，均未檢出。這與此類產(chǎn)品前期經(jīng)過(guò)初步凈制，單次用量獨(dú)立包裝，有些還抽真空有關(guān)。USP＜1112＞中介紹了利用水分活度控制藥品中微生物生長(zhǎng)的一般方法[1]，通過(guò)對(duì)飲片進(jìn)行適度干燥處理，并采用適宜的包裝材料及包裝方式等途徑控制其水分活度，對(duì)防止微生物污染有較大的影響。監(jiān)管相對(duì)較松的農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，飲片大都直接堆放在地上，銷售人員不注意衛(wèi)生，控制菌檢出率則相對(duì)偏高。建議在生產(chǎn)、儲(chǔ)存、運(yùn)輸過(guò)程中嚴(yán)格管理，采用有效的包裝形式、合適的儲(chǔ)存條件，防止微生物的多次污染。

本文試驗(yàn)過(guò)程中，僅參考《中國(guó)藥典》四部[3]進(jìn)行樣品檢查，尚未進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。因此單劑量獨(dú)立包裝樣品在計(jì)數(shù)檢驗(yàn)時(shí)均無(wú)菌落生長(zhǎng)，且未檢出控制菌，是否與經(jīng)過(guò)防腐處理相關(guān)有待考察。