鄭夢迪，賀紫涵，張寒，張彥

西安醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710021

土茯苓為百合科植物光葉菝葜Smilax glabraRoxb.的干燥根莖，味甘、淡，性平，具有除濕、解毒、通利關(guān)節(jié)的功能，在臨床中有較高的藥用價值[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，土茯苓具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、緩解動脈粥樣硬化、護(hù)肝、止咳祛痰、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用，為其藥品、保健食品的開發(fā)提供了思路[2]。但作為一種常用中藥，在采收、加工、使用過程中土茯苓不同品種混雜問題嚴(yán)重，且文獻(xiàn)記載不嚴(yán)謹(jǐn)、外觀表型相似和地方用藥習(xí)慣等原因?qū)е螺幂謱佟⑿ぽ幂謱偌捌渌茖俣喾N植物也被當(dāng)做土茯苓使用[2-3]。這些混淆品大致分為兩類，一類是以同屬（菝葜屬）植物黑果菝葜S.glaucochinaWarb.為主的“紅土茯苓”，即地方俗稱的“菝葜”；另一類是以百合科肖菝葜屬植物肖菝葜Heterosmilax japonicaKunth 為主的“白土茯苓”，即俗稱“土萆薢”。自古以來，四川和云南等地就有“土茯苓”“萆薢”“菝葜”混稱和混用的習(xí)慣。目前，各地中藥市場上土茯苓的混淆品較多，除主要混淆品菝葜、肖菝葜以外，還有菝葜屬和肖菝葜屬的多種植物，如馬甲菝葜、長托菝葜、小果菝葜、合絲肖菝葜等也被當(dāng)做土茯苓使用[4-5]。這種摻雜混淆品的現(xiàn)象，在一定程度上造成了土茯苓藥材來源的品種混亂和質(zhì)量良莠不齊，給土茯苓臨床用藥安全帶來隱患。傳統(tǒng)的中藥材鑒別手段要求鑒定人員具有較高的植物分類專業(yè)知識和技能，這使中藥材基原的準(zhǔn)確鑒別具有一定局限性。因此，需要一種更科學(xué)、準(zhǔn)確和穩(wěn)定的方法作為補(bǔ)充鑒別方法。

本研究采用近年來迅速發(fā)展的DNA 條形碼技術(shù)，可直接從基因水平上提供豐富的鑒別依據(jù)。此前，已有學(xué)者采用psbA-trnH序列對土茯苓的基原植物及其近緣種進(jìn)行鑒定，然而出現(xiàn)了部分物種種內(nèi)、種間無法識別的現(xiàn)象，matK、rbcL序列的變異位點也較少[6-7]。內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（internal transcribed spacer 2，ITS2）序列位于5.8 S和28 S rDNA 基因之間，具有長度短、易擴(kuò)增的特點，適用于植物屬、種的鑒定[8]，是目前植物分類研究和藥用植物鑒定常用的分子標(biāo)記之一[9-10]。在植物細(xì)胞中，ITS2 rDNA的二級結(jié)構(gòu)是由一級序列自身回折而形成部分堿基配對和單鏈交替出現(xiàn)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，真核生物ITS2 二級結(jié)構(gòu)為高度保守的“一環(huán)四臂”模型[11]。ITS2 二級結(jié)構(gòu)不僅包含系統(tǒng)發(fā)育信息，還可以補(bǔ)充和修正由于旁系同源或假基因所導(dǎo)致的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建誤差[12]。目前，關(guān)于土茯苓及其混偽品的鑒定研究尚無結(jié)合ITS2 核酸序列信息及其二級結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行親緣關(guān)系鑒定方面的研究[13]。因此，本研究建立更加成熟和標(biāo)準(zhǔn)的土茯苓DNA 條形碼鑒定方法，為其DNA條形碼的選擇提供參考。

1 材料

本研究選取了土茯苓及常見混偽品的ITS2 序列作為實驗研究對象，從GenBank 數(shù)據(jù)庫下載土茯苓正品來源光葉菝葜S.glabraRoxb.序列5 條、混偽品菝葜屬黑果菝葜S.glaucochinaWarb.序列4條、長托菝葜S.feroxWall.ex Kunth 序列3 條、馬甲菝葜S.lanceifoliaRoxb.ex A.DC.序列3 條、小果菝葜S.davidianaA.DC.序列4 條和圓錐菝葜S.bracteataC.Presl 序列3 條；以及來自肖菝葜屬的混淆品種肖菝葜H.chinensis（Kunth）A.DC.序列3 條、合絲肖菝葜H.japonicaKunth var.gaudichaudiana（Kunth）Wang et Tang 序列3 條和短柱肖菝葜H.yunnanensisGagnep.序列3 條。GenBank樣本序列號及其對應(yīng)物種信息見表1。

表1 GenBank土茯苓及其混偽品序列號及其對應(yīng)物種信息

2 方法

2.1 ITS2序列的獲取、注釋及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

在GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中選擇Nucleotide 數(shù)據(jù)庫，下載正品土茯苓及其混淆物種的ITS2 序列，再采用Blast 功能和序列注釋信息剔除可疑序列。基于隱馬爾可夫模型（HMM）[14]在ITS2 Database[15]中注釋下載的每一條ITS 序列，去除兩端5.8 S 和28 S 區(qū)域，得到經(jīng)注釋后完整的ITS2序列，再利用ITS2數(shù)據(jù)庫對各樣本進(jìn)行ITS2二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。

2.2 傳距離及聚類分析

使用MEGA 7.0軟件[16]統(tǒng)計30個樣本ITS2序列的堿基含量，利用在線網(wǎng)站clustal omega（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）對收集到的30 個樣本進(jìn)行同源對比，最終統(tǒng)計得出變異位點；基于Kimura-2-Parameter（K2P）模型進(jìn)行遺傳距離的計算，鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，設(shè)置bootstrap 分析1000 次重復(fù)以檢測分支的可靠性。

2.3 ITS2一級序列聯(lián)合二級結(jié)構(gòu)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

通過ITS2 Database 下載各樣本的一級和二級結(jié)構(gòu)聯(lián)合后的矩陣，將所有樣本矩陣導(dǎo)入4Sale 1.7.1軟件[17]進(jìn)行比對。比對完成后構(gòu)建ITS2 一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)系統(tǒng)發(fā)育樹，比對好的結(jié)果導(dǎo)入ProfDistS軟件[18]中，基于距離法構(gòu)建剖面鄰接（profile neighbor joining，PNJ）系統(tǒng)發(fā)育樹，同樣設(shè)置bootstrap 自展分析1000 次來檢驗系統(tǒng)發(fā)育樹分支關(guān)系的可靠性。

3 結(jié)果

3.1 ITS2序列特征及差異性分析

對土茯苓及其混偽品進(jìn)行ITS2 序列分析，如表2 所示，正品土茯苓光葉菝葜的序列長度平均值為245 bp，G+C 占比為82.70%；菝葜屬混偽品黑果菝葜、長托菝葜、馬甲菝葜、小果菝葜及圓錐菝葜ITS2平均序列長度為247、245、242、244、243 bp、G+C 占比為81.00%、78.40%、79.80%、81.00%、81.20%；肖菝葜屬肖菝葜、合絲肖菝葜、短柱肖菝葜ITS2 平均序列長度分別為249、247、248 bp，G+C 占比分別為82.00%、81.60%、82.20%。土茯苓與各混偽品的變異位點數(shù)目和位置均存在差異（表3）。正品土茯苓（光葉菝葜）種內(nèi)變異位點僅存在于222 位，共有2 種單倍型（A1 和A2），A1 包括4 條序列，堿基為A，占比80%；A2 包括1 條序列，堿基為C，占比20%。

表2 土茯苓及其混偽品序列特征

表3 土茯苓及其混偽品ITS2序列變異位點

3.2 遺傳距離分析

基于K2P 模型在MEGA 7 中計算遺傳距離。如表4 所示，土茯苓及各個混偽品的種內(nèi)遺傳距離均為0；而各種間遺傳距離為0.008～0.059。其中，種間最小遺傳距離為土茯苓和短柱肖菝葜0.008，種間最大遺傳距離為長托菝葜和合絲肖菝葜0.059。土茯苓與其混偽品黑果菝葜的遺傳距離為0.021，與土茯苓遺傳距離最大的品種為長托菝葜0.044。

表4 土茯苓及其混偽品遺傳距離

3.3 ITS2二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及分析

本實驗利用ITS2 一級序列和二級序列聯(lián)合矩陣，導(dǎo)入4Sale 1.7.1 軟件中，得到土茯苓及其混偽品的二級結(jié)構(gòu)。如圖1 所示，二級結(jié)構(gòu)為典型的“一環(huán)四臂”結(jié)構(gòu)，臂Ⅲ為最長臂，其余臂長長度近似，但臂Ⅱ的結(jié)構(gòu)最為保守，臂Ⅳ上有較大變異，中間的主環(huán)也較為保守，符合《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版規(guī)定的真核生物二級結(jié)構(gòu)模型。對比各二級結(jié)構(gòu)的臂Ⅰ，土茯苓有1個發(fā)夾環(huán)和1個內(nèi)環(huán)，混偽品中的圓錐菝葜含2 個內(nèi)環(huán)；在臂Ⅱ上，除短柱肖菝葜無嘧啶-嘧啶錯配的內(nèi)環(huán)外，土茯苓與其余混偽品均包含1 個內(nèi)環(huán)。然而，在臂Ⅲ和臂Ⅳ中土茯苓與其他混偽品的區(qū)別最大。在臂Ⅲ上，從各內(nèi)環(huán)的大小上看，馬甲菝葜的嘧啶-嘧啶錯配環(huán)明顯大于土茯苓及其他混偽品；從內(nèi)環(huán)數(shù)目上來看，短柱肖菝葜臂內(nèi)環(huán)數(shù)最多有7個，圓錐菝葜和黑果菝葜的內(nèi)環(huán)數(shù)較少，含4個內(nèi)環(huán)；且圓錐菝葜和黑果菝葜的內(nèi)環(huán)位置也與其他物種有明顯差異。在臂Ⅳ中，長托菝葜較其他品種多一個內(nèi)環(huán)；臂Ⅳ上突環(huán)的大小也有較大差異，如長托菝葜、肖菝葜、長托肖菝葜、合絲肖菝葜明顯大于土茯苓及其他混偽品。綜上所述，土茯苓與其最常見的混偽品黑果菝葜、肖菝葜在臂Ⅲ、臂Ⅳ有較明顯的特征，如黑果菝葜臂Ⅲ較土茯苓和肖菝葜多1 個內(nèi)環(huán)；肖菝葜在臂Ⅳ上的突出單鏈較土茯苓和黑果菝葜長。

圖1 土茯苓及其混偽品的二級結(jié)構(gòu)

3.4 NJ進(jìn)化樹和PNJ聚類樹的系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究利用ITS2 序列和一級序列及二級結(jié)構(gòu)聯(lián)合矩陣分析，分別構(gòu)建了土茯苓與其混偽品的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹和PNJ系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。在構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹中結(jié)果顯示，土茯苓與黑果菝葜、肖菝葜及其他混偽品均分別聚類，不同物種各自聚為一支，且自展支持率均在60%以上的支系有9 個、80%以上的有6個、90%以上的有4個，說明不同混偽品與土茯苓的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。另外，PNJ 系統(tǒng)發(fā)育樹也表明了相同的分支情況，且分支更多，顯示出更多的遺傳信息，具有較好的單系性，在自展支持率上也有所提高。2 種系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果均說明ITS2 序列適用于土茯苓及其混偽品或近緣種的鑒別。

圖2 土茯苓及其混偽品的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹及PNJ系統(tǒng)發(fā)育樹

4 討論

ITS2 是《中國藥典》2020 年版規(guī)定可用于植物物種鑒定的一種核心條形碼，也是系統(tǒng)發(fā)育分析最常用的基因之一，ITS2 序列較短，相比ITS 有著更高的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增成功率[19]。陳士林等[20]建議將ITS2序列作為藥用植物的核心DNA條形碼。《中國藥典》2010、2015 年版已收錄基于ITS2 序列鑒定藥用植物的方法，并且在藥用植物的分類鑒別中取得初步進(jìn)展。然而，單獨將ITS2 一級序列作為分子標(biāo)記仍有一定局限性。首先，ITS2 不能滿足所有科屬植物的鑒別，如在杜鵑屬中的鑒別效率僅為21.9%[21]；其次，ITS2 序列變異速度快，更適用于屬以下級別物種的鑒別[22]。而ITS2 二級結(jié)構(gòu)為不同物種的比對分類提供了一級序列未包含的更多信息。ITS2 二級結(jié)構(gòu)有保守性結(jié)構(gòu)“一環(huán)四臂”，因其“一環(huán)四臂”的結(jié)構(gòu)有助于指導(dǎo)一級核酸序列的排列，對于一級核酸序列起到校正的作用[11-12]。

本研究通過對土茯苓及其混偽品ITS2 序列分析，搜集到的土茯苓ITS2 序列種內(nèi)在222 bp 位點有1 個變異位點，保守性高、穩(wěn)定性好；同時，遺傳距離結(jié)果表明，土茯苓種內(nèi)遺傳距離為0，遠(yuǎn)小于土茯苓與其他混偽品的種間最小遺傳距離0.008，符合“種間遺傳距離符合10 倍以上”的種內(nèi)遺傳原則；聯(lián)合一、二級結(jié)構(gòu)共同構(gòu)建的PNJ 系統(tǒng)發(fā)育樹分析，得到與一級結(jié)構(gòu)NJ系統(tǒng)發(fā)育樹相對應(yīng)的分支情況，同時使得系統(tǒng)發(fā)育樹分支變多，提高了個別物種的自展支持率，PNJ 系統(tǒng)發(fā)育樹對NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹起到了修正優(yōu)化作用，即土茯苓可與其混偽品區(qū)分開；同時，正品土茯苓與混偽品的二級結(jié)構(gòu)在各臂上環(huán)的數(shù)量、大小等存在較大的差異，二級結(jié)構(gòu)的差異可以作為一種額外的信息指導(dǎo)土茯苓及其混偽品的鑒別。建議ITS2 可以作為鑒別土茯苓及其混偽品的DNA 條形碼。本研究為藥用正品土茯苓及其混偽品的準(zhǔn)確鑒定提供了參考。