李紅梅，魏艷麗，扈進冬，楊凱，劉寶軍，楊合同，BAZHANAU Dzmitry，李紀順

(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)，山東省科學(xué)院生態(tài)研究所,山東省應(yīng)用微生物重點實驗室，山東 濟南 250103)

阿特拉津(2-氯-4-二乙胺基-6-異丙胺基-1,3,5-三嗪，Atrazine)是世界范圍內(nèi)廣泛使用的三嗪類除草劑，主要應(yīng)用于玉米、甘蔗、高粱田及草坪雜草的防除。因其溶淋性好、遷移率高、持效期長，已造成多個國家的土壤和地表、地下水污染[1]。土壤的物理及化學(xué)性質(zhì)不同，阿特拉津在土壤中的半衰期從21天到一年不等，易對后茬敏感作物產(chǎn)生藥害[2]。而且，阿特拉津還干擾人和動物的內(nèi)分泌，具有潛在的生態(tài)風(fēng)險[3-5]。因此，阿特拉津污染環(huán)境的生物修復(fù)成為人們關(guān)注的熱點。

阿特拉津在環(huán)境中通過化學(xué)脫氯和微生物作用進行降解[6]，微生物修復(fù)是降低土壤中阿特拉津的主要途徑，具有經(jīng)濟、高效、無二次污染等優(yōu)點[7]。Zhang等[8]研究表明，降解菌DNS10能有效去除土壤中的阿特拉津，修復(fù)效果顯著。因此，向阿特拉津污染土壤中施加降解菌的方法，能達到去除的目的。本課題組前期從山東省玉米田中分離到一株阿特拉津高效降解菌DnL1-1，經(jīng)鑒定為產(chǎn)脲節(jié)桿菌(Arthrobacterureafaciens)[9]。為提高菌株DnL1-1的發(fā)酵水平，本文通過單因子篩選、正交試驗對菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，確定了最佳培養(yǎng)基配方，以期為其工業(yè)化生產(chǎn)及推廣應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

產(chǎn)脲節(jié)桿菌(A.ureafaciens)DnL1-1，系本實驗室分離保存，菌株保藏號CGMCCNO. 9667。

1.2 培養(yǎng)基

TY培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物1 g/L，氯化鈣0.2 g/L，pH 7.2；固體培養(yǎng)基添加1.0%的瓊脂。

SMY培養(yǎng)基[10]：磷酸氫二鉀0.5 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，氯化鈉0.1 g/L，氯化鈣0.02 g/L，檸檬酸三鈉0.5 g/L，硫酸亞鐵0.02 g/L，硫酸鋅0.002 g/L，葡萄糖2 g/L，阿特拉津0.5 g/L，酵母提取物0.1 g/L。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母提取物0.1 g/L， 磷酸氫二鉀0.5 g/L，磷酸二氫鉀0.25 g/L，硫酸鎂0.1 g/L，氯化鈣0.1 g/L。

1.3 培養(yǎng)方法

1.4 菌體測定方法

采用SMY平板活菌計數(shù)，每濃度重復(fù)3次。

1.5 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

在菌株發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別對碳源(葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、玉米粉，20g/L)、氮源(尿素、酵母、蛋白胨、牛肉浸粉、豆餅粉，15 g/L)、無機鹽(磷酸氫二鉀1 g/L、磷酸二氫鉀0.5 g/L、氯化鈣0.1 g/L、硫酸鎂0.1 g/L)等進行了篩選，確定最佳碳氮源、無機鹽及濃度。

1.6 正交試驗

在單因素分析基礎(chǔ)上，利用正交設(shè)計分析實驗結(jié)果，確定最佳培養(yǎng)基配方。實驗分別篩選發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的最佳碳氮源及濃度，再結(jié)合 L18( 37) 正交試驗對培養(yǎng)基中碳源、氮源、酵母提取物及無機鹽進行優(yōu)化。發(fā)酵結(jié)束后活菌計數(shù)，菌數(shù)最高的處理為最佳。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源的篩選

選用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、玉米粉、可溶性淀粉為碳源，培養(yǎng)36 h后進行平板活菌計數(shù)。圖1、圖2結(jié)果顯示葡萄糖為最佳碳源，其對菌株的生長有很好的促進作用，且最佳濃度為20 g/L。

2.2 氮源的篩選

以等量氮源替換基礎(chǔ)氮源，考查不同氮源對菌株生長的影響。如圖3、圖4所示，酵母粉做氮源，菌株的生物量最高；蛋白胨做唯一氮源時，菌體生長量下降。從以往發(fā)酵經(jīng)驗來看，酵母粉作為生長因子是發(fā)酵培養(yǎng)基中必不可少的成分，如圖5所示，我們以蛋白胨作為氮源，同時添加少量酵母粉獲得不錯的生物量。綜合考慮，以蛋白胨作為氮源，同時加入少量酵母粉為生長因子。

圖1 不同碳源對菌體生長的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on the DnL1-1 growth

圖2 不同葡萄糖濃度對菌體生長的影響Fig.2 Effect of different glucose concentrations on the DnL1-1 growth

圖3 不同氮源對菌體生長的影響Fig.3 Effect of different nitrogen sources on the DnL1-1 growth

圖4 不同蛋白胨濃度對菌體生長的影響Fig.4 Effect of different peptone concentrations on the DnL1-1 growth

圖5 蛋白胨+酵母粉組合對菌體生長的影響Fig.5 Effect of peptone + yeast powder combination on the DnL1-1 growth

2.3 正交試驗

發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗因素和水平設(shè)計見表1，所選7個因素為葡萄糖A、蛋白胨B、酵母提取物C、磷酸氫二鉀D、磷酸二氫鉀E、氯化鈣F、硫酸鎂G。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗因素和水平設(shè)計

表2 正交試驗結(jié)果

3 討論與結(jié)論

近年來，研究者主要著重于降解菌的生物特性、降解特性及機理等方面的研究[11-13]，但菌株用于土壤污染修復(fù)的研究報道較少，且都局限于室內(nèi)盆栽實驗[14]。本研究中的產(chǎn)脲節(jié)桿菌DnL1-1，能有效在作物根際定殖，且室內(nèi)模擬實驗對阿特拉津污染土壤的修復(fù)效果較好[15]，尤其是對低濃度污染土壤的修復(fù)效果顯著，因此，該菌株具有良好的生產(chǎn)應(yīng)用價值。

菌株的發(fā)酵水平是其應(yīng)用的基礎(chǔ)，發(fā)酵條件的優(yōu)化可以提高發(fā)酵的產(chǎn)量，降低實際修復(fù)的成本。本研究經(jīng)單因素試驗發(fā)現(xiàn)，在碳源的選擇上DnL1-1更適合在葡萄糖中生長，這與相關(guān)報道一致[16]，但也有些節(jié)桿菌在淀粉中生長更好[17]，這有可能是在節(jié)桿菌屬中種的不同而導(dǎo)致最適碳源的差異。在氮源的選擇上，酵母粉適合該菌株的生長，但考慮到生產(chǎn)成本，綜合發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基以蛋白胨為氮源添加少量酵母粉作為生長因子，也能達到很好的生長量。最終篩選出DnL1-1的培養(yǎng)基配方為：葡萄糖15.0g/L，蛋白胨7.5g/L，酵母提取物 0.50g/L，磷酸氫二鉀2.0g/L，磷酸二氫鉀1.0g/L，氯化鈣0.15g/L，硫酸鎂0.15g/L。

產(chǎn)脲節(jié)桿菌DnL1-1優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方，發(fā)酵液菌體數(shù)量較優(yōu)化前有了顯著提高。本研究是在實驗室搖瓶發(fā)酵條件下進行的，若要實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，還需在發(fā)酵罐條件下進行發(fā)酵工藝參數(shù)及后處理工藝參數(shù)的優(yōu)化實驗，同時要進行相關(guān)劑型的研究開發(fā)，后續(xù)工作正在進行中。