扈進冬，吳遠征，魏艷麗，李紅梅,辛相啟，楊凱,李紀順*

(1.齊魯工業(yè)大學(山東省科學院)，山東省科學院生態(tài)研究所，山東 濟南 250103；2. 山東省農業(yè)科學院植物保護研究所，山東 濟南 250100)

根際土壤即植物根系周圍受到根系生長影響的土壤部分，最早由德國微生物學家Lorenz Hiltner于1904首先提出，是由植物根部生態(tài)系統與土壤生態(tài)系統共同作用形成的交互區(qū)域[1]。在植物根際土壤中存在兩大類的微生物，其中一類能促進植物生長，是對植物有益的微生物，可以通過營養(yǎng)競爭、拮抗作用和誘導系統抗性等機制抑制土壤中病原菌，進而促進植物生長[2]；另外一類微生物影響植物生長，是對植物有害的微生物，其積累常常會導致植株的大量死亡[3]。在這些有害的微生物所引起的植物病害中，大部分病害是由病原真菌侵染引起的，常常給農業(yè)生產造成巨大的經濟損失[4]。

小麥根部真菌病害是嚴重危害小麥生產的一種常見性病害，楊韶勇等[5]報道小麥真菌病害有70種，其中土傳病害比地上部的病害更難防控，如小麥紋枯病、根腐病等已經成為影響小麥產量的重要因素之一。目前，多采用化學藥劑進行防治，但長期使用易產生藥害，病原菌也產生抗藥性，而且污染環(huán)境。通過使用根際有益微生物可以誘導植物抗性、增加根際土壤中的生物多樣性，從而控制根際真菌病害，減少環(huán)境污染。木霉菌作為一種根際有益微生物，可以有效防治多種病原真菌引起的小麥病害[6-8]。為了解生防木霉對小麥發(fā)育期根際微生物群落的影響，本試驗以哈茨木霉LTR-2為供試菌株拌種處理小麥，通過高通量測序技術解析了根際土壤真菌群落特征，以及其與木霉菌拌種之間的相關性，為利用木霉菌防治小麥真菌病害提供了重要的理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與試驗地概況

2017年10月于山東省科學院東區(qū)試驗田中進行田間試驗，試驗點前茬作物為花生，地勢平坦，灌溉條件良好，土壤為砂質壤土，有機質含量1.3%，pH 7.3，土壤肥力基本均勻一致。播種前施用硫酸鉀復合肥(m(N)∶m(P)∶m(K)=15∶15∶15)750 kg/hm2，返青拔節(jié)期追施相同化肥150 kg/hm2。2017年10月16日播種，播種量112.5 kg/hm2。小麥品種為魯原502，泰安登豐種業(yè)有限公司提供，試驗所用LTR-2種衣劑(2×108cfu/g)為實驗室制備，5%戊唑醇懸浮種衣劑為青島翰生生物科技股份有限公司生產。

1.2 試驗設計

試驗采取隨機區(qū)組排列，按藥劑處理及空白對照共3個處理,每處理30 m2，3次重復，小區(qū)面積30 m2，試驗地四周設保護區(qū)。土壤樣品采集于2017年11月14日、12月15日、2018年3月15日、4月15日、5月15日分5次采樣，每個小區(qū)隨機取5個樣點，每樣點隨機選取10株麥苗，挖出根系，用抖根法采集附著在根際表面的土壤，混勻后為該樣點的根際土壤樣品。每個處理的3個小區(qū)的根際土壤樣品混合成1個樣品，將土壤樣品過20目細篩，凍存于-80 ℃冰箱中備用。

1.3 土壤微生物基因組DNA提取和PCR擴增

提取試劑盒為Omega土壤微生物DNA提取試劑盒，稱取0.5 g -80 ℃保存的土壤樣品，按試劑盒的試驗步驟進行土壤微生物總DNA的提取，DNA樣品于-20 ℃保存待用。

提取樣品總DNA后，PCR所用的引物為帶標簽序列的Miseq測序平臺的ITS3-4通用引物， ITS4F(TCCTCCGCTTATTGATATGC)和ITS3R(GCATCGATGAAGAACGCAGC)進行兩輪擴增，第一次PCR反應體系：含2×Taq master Mix 15 μL，Bar-PCR primer F (10 μmol/L)1.0 μL，Primer R (10 μmol/L)引物1.0 μL，Genomic DNA 10～20 ng，雙蒸水補足至體積30 μL。PCR反應條件：94 °C 3 min；94 °C 30 s，45 °C 20 s，72 °C 30 s，5個循環(huán)；94 °C 20 s，55 °C 20 s，72 °C 30 s，20個循環(huán)；72 °C 5 min，PCR結束后進行第二輪擴增。第二輪PCR擴增引入Illumina橋式PCR兼容引物，反應體系含2×Taq master Mix 15 μL，primer F(10 μmol/L) 1.0 μL，Primer R(10 μmol/L)1.0 μL，PCR 產物(上一輪)20 ng，雙蒸水補足至體積30 μL。PCR反應條件：94 °C 3 min；94 °C 20 s，55 °C 20 s，72 °C 30 s，5個循環(huán)；72 °C 5 min。然后對其產物進行純化、定量和均一化形成測序文庫，建好的文庫先進行文庫質檢，質檢合格的文庫用Illumina MiSeq PE250進行測序，由上海生工生物工程股份有限公司完成Miseq測序。

1.4 高通量測序結果的數據處理及分析

Miseq測序完成后，采用軟件cutadapt去除引物接頭序列，再根據PE reads之間的overlap關系，使用PEAR將成對的reads序列進行序列拼接，Prinseq對各樣本數據的質量進行質控過濾，使用Usearch去除預處理后序列中非擴增區(qū)域序列，而后對序列進行測序錯誤校正，并調用uchime進行嵌合體鑒定。隨后，再將去除嵌合體的序列與數據庫代表性序列進行blastn比對，低于閾值的比對結果認為是靶區(qū)域外序列，并剔除掉該部分序列，得到各樣本有效數據。根據序列之間的相似性將序列分成不同的操作分類單元 (OTU)，在97%的相似水平下的OTU進行生物信息統計分析。在分析時將同一處理的5個不同發(fā)育時期的取樣樣品作為一個小組，木霉菌拌種處理、戊唑醇拌種處理和不拌種處理(空白對照)3個不同處理整體作為一個大的展示組進行統計分析，利用Mothur 軟件計算文庫覆蓋率(Coverage)，Chao1指數及Shannon指數計算方法見文獻[9]。采用R語言分析繪制樣品OTUs的韋恩圖。

2 結果與分析

2.1 不同拌種處理小麥根際土壤真菌群落豐富度和多樣性變化

木霉菌能夠防治小麥紋枯病、莖基腐病等多種小麥真菌病害，具有部分替代化學殺菌劑的潛力，而化學殺菌劑戊唑醇是目前小麥拌種過程中最常用的拌種劑之一，因此，我們選用戊唑醇作為對照藥劑，希望通過研究不同拌種處理對小麥發(fā)育期根際微生物群落的影響，來指導木霉菌拌種劑在小麥生產過程中的使用。

群落豐富度(community richness)的指數，包括Chao 指數和ACE 指數，是采用不同算法估計樣品中所含OTU 數目的指數，可反映群落物種豐富度，Chao 或ACE指數越大，表明樣品中生物群落豐富度越高。由表1可以看出木霉菌LTR-2拌種處理和戊唑醇藥劑拌種處理相較于不拌種處理的群落豐富度增加，其根際土壤真菌的Chaos指數分別增加了14.5%和43.9%，ACE指數分別增加了17.8%和 52.4%，表明拌種處理小麥可以增加小麥根際真菌的豐富度。

Simpson指數和Shannon指數反映了群落的物種多樣性。其中Shannon指數反映的是群落的均勻度，Simpson指數則反映的是群落的優(yōu)勢度，其數值越大，表明生物群落內不同種類生物數量分布越不均勻，優(yōu)勢生物的生態(tài)功能越突出。由表1可知，雖然木霉拌種處理和戊唑醇藥劑拌種處理和不拌種處理的小麥根際真菌的Shannon指數沒有明顯的區(qū)別，但木霉拌種處理的根際真菌Simpson指數相較于戊唑醇拌種處理和不拌種處理的小麥增加了24.5%和19.6%，這個結果表明，木霉LTR-2拌種處理可以增加土壤真菌群落中優(yōu)勢生物的生態(tài)功能，但并不影響其他真菌在真菌群落中的分布。

表1 小麥拌種處理根際土壤真菌多樣性指數

2.2 拌種處理小麥根際土壤真菌群落結構的變化

拌種和不拌種處理小麥根際土壤真菌群落在門分類上的分布比例見圖1。高通量測序的結果表明，各處理小麥根際土壤中鑒定得到的真菌主要來自 6 個門，包括子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、鞭毛菌門 (mortierellomycota)、壺 菌 門 (Chytridiomycota ) 、綠藻門(Chlorophyta)和毛霉亞門(Mucoromycota)。其中，優(yōu)勢菌群為子囊菌門、擔子菌門和鞭毛菌門，這三種真菌在木霉、戊唑醇藥劑和不拌種處理的小麥根際土壤中分別占真菌群落的 87.63%、85.47%和 91.12%。其中，兩種拌種處理樣品中子囊菌門真菌所占比例相較于不拌種分別減少1.64%和1.82%；鞭毛菌門真菌在兩種拌種處理中比例分別減少了2.16%和2.25%；而擔子菌門木霉拌種處理較不拌種比例略有增加，戊唑醇藥劑拌種處理較不拌種比例減少了1.47%。上述結果表明，各處理中根際土壤真菌群落結構構成相近，但拌種處理的小麥根際土壤各真菌類群所占比例發(fā)生了明顯的變化。

進一步從屬的角度(圖2)分析發(fā)現，各處理中根際土壤真菌群落在屬水平上結構構成也是相近的，但各真菌類群所占比例同樣發(fā)生了明顯的變化。各處理小麥根際土壤優(yōu)勢種屬有鏈格孢屬(Alternaria)、赤霉屬(Gibberella)、畸枝霉屬(Malbranchea)、枝孢霉屬(Cladosporium)、鐮刀菌屬(Fusarium)、孢霉屬(Mortierella)、假裸囊菌屬(Pseudogymnoascus)、腐殖菌(Humicola)。其中木霉拌種處理的小麥根際土壤中鏈格孢屬、赤霉屬、鐮刀菌屬所占比例較不拌種處理均有所降低，分別減低6.05%、5.25%、0.40%；戊唑醇拌種處理的小麥其根際土壤中鏈格孢屬、鐮刀菌屬所占比例較不拌種處理降低了6.37%和1.04%，而赤霉屬所占比例反而增加了4.47%。眾所周知，鏈格孢屬、赤霉屬、鐮刀菌屬中有些種常會引起小麥真菌性病害，上述研究結果表明，采用拌種處理小麥可以降低小麥病原真菌在其根際土壤中的豐度，減少了病原真菌積累、降低了病害發(fā)生的幾率，推測這是拌種處理防治病害發(fā)生的作用機制之一。

圖1 門水平上的根際土壤真菌相對豐度柱形圖Fig 1 The relative abundance of the soil fungal in rhizosphere relative to phylum level

圖2 屬水平上的根際土壤真菌相對豐度柱形圖Fig.2 The relative abundance of the soil fungal in rhizosphere relative to genus level

2.3 不同拌種處理小麥根際土壤真菌群落OTU的特點

韋恩圖可用于統計多個樣品中所共有和獨有的OTU 數目，從而直觀地展現出樣品中OTU 數目組成一致性及獨有的情況。由圖3可知，木霉LTR-2、戊唑醇和不拌種處理的小麥根際土壤之間存在共有真菌OTU 數量為800個(這個發(fā)育期5次取樣樣品總和)，木霉拌種處理的小麥根際土壤存在3 025個特異的真菌OTU，戊唑醇拌種劑處理的小麥根際土壤存在3 720個真菌OTU，而沒有經過拌種處理的小麥根際特異的真菌OTU僅有2 834個，拌種處理所獨有的真菌OTU數目均比不拌種處理的小麥根際土壤中的真菌OTU數量多，推測原因可能為拌種處理改變原有的真菌群落的動態(tài)平衡，使根際生態(tài)系統更容易接收獲得外源性的特異性真菌類群，從而豐富了根際土壤中真菌的種類，但相對來說木霉菌LTR-2拌種處理對于真菌群落動態(tài)平衡的改變緩和些，而化學藥劑處理則劇烈些，這種結果其實也與化學藥劑殺菌沒有選擇性是一致的。

圖3 木霉拌種處理小麥根際土壤真菌Venn圖Fig.3 Venn diagrams of soil fungal community in wheat rhizosphere under Trichoderma seed coatings

3 討論

通過對木霉菌拌種小麥的根際土壤中真菌群落進行宏基因組的高通量測序，發(fā)現木霉菌LTR-2拌種處理增加了小麥根際土壤中真菌群落的豐富度，并且其中有些真菌群落的優(yōu)勢度也發(fā)生了明顯的改變，更為重要的是通過木霉拌種處理，根際土壤中一些小麥病原真菌的比例降低了[7]。以引起小麥根腐病的真菌離蠕孢菌(bipolarissorokinian)為例，高通量測序結果中發(fā)現在各處理根際土壤樣品中均有分布，但在木霉菌拌種處理的樣品中其豐度明顯降低，僅為不拌種處理樣品的12%，而戊唑醇拌種的樣品中離蠕孢菌的豐度則是不拌種處理樣品的2.4倍。黃世文等[10-11]報道木霉菌可以防治小麥根腐病，猜測通過木霉菌拌種可能通過占據生態(tài)位點等方式有效減少根際土壤中離蠕孢菌的含量，這可能也是其防病的作用機制之一。而戊唑醇作為一種內吸殺菌劑，能有效防治吸附在種子表面以及內部的病原菌，但并不能改變對土壤中或根際的病原菌的豐度，而豐度增加的原因尚不明了，因此，木霉拌種可能更適用于防治離蠕孢菌所引起的小麥根腐病。研究表明，發(fā)生植物土傳病害的根際土壤中微生物多樣性會降低，而引入外源生防菌能提高植物根際土壤中微生物的多樣性，如譚兆贊等[12]通過使用接種微生物菌劑的堆肥提高了土壤中微生物的多樣性，從而降低了番茄青枯病的發(fā)生；韓騰等[13]通過施用生防菌株枯草芽孢桿菌 (Bacillussubtilis) Tpb55提高了煙草根際土壤細菌多樣性和群落結構穩(wěn)定性，從而對煙草黑脛病有較好的防治效果，能減輕發(fā)病程度，延遲發(fā)病時間。因此，提高土壤及根際土壤的微生物多樣性可能是生防菌發(fā)揮良好生防作用的重要機制之一。除此之外，通過木霉拌種還明顯降低了根際土壤中鏈格孢屬、赤霉屬、鐮刀菌屬真菌的比例，這些改變也預示著木霉拌種對引發(fā)小麥土傳病害的病原真菌具有積極的預防作用。