古蘭·托合提木拉提，葉爾努爾·吐蘇甫汗，馬玉蘭，瑪依努爾·尼亞孜

(1.新疆自治區(qū)人民醫(yī)院，烏魯木齊 830001；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，烏魯木齊 830001)

肥胖與女性的生殖功能障礙和不孕有關(guān)，肥胖女性比正常體重的女性更容易出現(xiàn)多囊卵巢綜合征(PCOS)、月經(jīng)不調(diào)等問題。PCOS是女性不孕癥最常見的原因，研究發(fā)現(xiàn)約40%～80%的PCOS患者肥胖[1]。肥胖和PCOS均存在多種合并癥，如高胰島素血癥、胰島素抵抗以及其他代謝紊亂等[2]。此外，研究表明肥胖可進(jìn)一步加劇PCOS患者的這些癥狀[3]。目前低熱量和低脂肪飲食是改善PCOS肥胖女性代謝和卵巢功能的有效療法[4]，但很少有研究將飲食本身作為PCOS的潛在病因。有研究發(fā)現(xiàn)高脂肪飲食可損害生殖健康并降低嚙齒動物的生育能力[5]，而因此將高脂飲食與藥物誘導(dǎo)PCOS動物模型相結(jié)合，但很少有研究單獨檢測飲食對PCOS及肥胖的發(fā)展的影響及兩者直接的聯(lián)系。本研究擬通過高脂肪高糖(high fat and high sugar，HFHS)飲食誘導(dǎo)雌性大鼠PCOS，評估大鼠代謝和生殖特征，以探討HFHS飲食對PCOS產(chǎn)生和發(fā)展的影響。

材料與方法

一、實驗動物

23日斷奶SPF級Sprague Dawley(SD)雌性大鼠36只購置于新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心(許可證號：SYXK(新)2013-0003)。飼養(yǎng)溫度(22±2)℃，相對濕度(55±5)%，12 h晝夜交替，清潔飼養(yǎng)，自由飲水，環(huán)境安靜，飼養(yǎng)環(huán)境符合SPF要求。

二、試劑與儀器

普通顆粒飼料(100%基礎(chǔ)飼料；含65%碳水化合物、21.5%蛋白質(zhì)、4%脂肪和9.5%其他)和高脂肪飼料(24%基礎(chǔ)飼料、18%豬油、18%豆油、32%蔗糖、6%酪蛋白、2%其他)購自于新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

ACS-1.51A電子秤購自于上海友聲衡器有限公司。XS205分析天平購自于瑞士梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。血糖儀購自于德國羅氏診斷有限公司。全自動生化分析儀購自于美國Beckman公司。

三、實驗方法

1.動物分組及模型制作：23日齡SD大鼠隨機分為對照組(n=18)和HFHS組(n=18)。對照組采用普通顆粒飼料，HFHS組采用高脂高糖飼料，分別連續(xù)喂養(yǎng)14周。

2.大鼠體重及動情周期監(jiān)測：每周稱重兩組大鼠體重并記錄。喂養(yǎng)第6～14周對每只大鼠進(jìn)行陰道涂片檢查，用生理鹽水(0.9% NaCl)清洗陰道收集陰道壁上的細(xì)胞并涂抹在玻片上。在顯微鏡下檢查玻片上的有核上皮細(xì)胞、角化上皮細(xì)胞和白細(xì)胞的相對豐度，觀察大鼠動情周期變化。通過發(fā)情期、發(fā)情間期、發(fā)情前期各個階段持續(xù)天數(shù)除以整個發(fā)情周期天數(shù)，計算發(fā)情周期各個階段所占時間比例。

3.卵巢重量及組織學(xué)檢查：飲食暴露14周后，處死大鼠并分離卵巢。稱取卵巢重量后，以卵巢最大平面作為待檢面，將其包埋在石蠟中，切成4～5 μm的切片，隨后用蘇木精-伊紅染色后觀察。計數(shù)每個卵巢囊性卵泡(cyst)和黃體(Corpora lutea，CL)數(shù)量。

4.空腹血糖、空腹胰島素、胰島素抵抗指數(shù)、血清血脂及性激素檢測：每組大鼠在同一個發(fā)情周期中，分別于禁食過夜后，次日空腹采尾靜脈血。使用血糖儀測定空腹血糖(Fasting glucose，F(xiàn)G)；采用放射免疫法檢測空腹胰島素(Fasting insulin，F(xiàn)I)。穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)計算：HOMA-IR =FI×FG/22.5。

采用全自動生化分析儀檢測血清總膽固醇(Total Cholesterol，TC)和三酰甘油(Triglycerides，TG)；采用放射免疫法測定血清LH、FSH、E2、孕酮(P)、睪酮(T)水平。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、兩組體重增長曲線

HFHS組大鼠體重至第3周起顯著高于對照組(F=80.17，P<0.001)(圖1)。第14周喂養(yǎng)結(jié)束時，HFHS組大鼠體重顯著高于對照組[(379.0±11.1)g vs. (315.0±6.2)g，P<0.001]。

同時段兩組比較，*P<0.001圖1 兩組體重增長曲線

二、兩組發(fā)情周期變化

陰道涂片評估發(fā)情周期發(fā)現(xiàn)，HFHS組出現(xiàn)不規(guī)則的發(fā)情周期和無排卵。第14周喂養(yǎng)結(jié)束時，HFHS組發(fā)情期持續(xù)時間顯著長于對照組(P<0.001)，而發(fā)情前期和發(fā)情間期持續(xù)時間則顯著短于對照組(P<0.001)(表1)。

三、兩組卵巢重量和卵巢組織形態(tài)學(xué)變化

HFHS組的卵巢重量與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。HFHS組卵巢平均囊性卵泡數(shù)顯著多于對照組，而卵巢平均黃體數(shù)顯著低于對照組(P<0.001)(表2、圖2)。

四、兩組空腹血糖、胰島素、HOMA-IR、血脂及激素水平變化

HFHS組空腹胰島素和HOMA-IR顯著高于對照組(P<0.001)，提示HFHS組大鼠也表現(xiàn)出胰島素抵抗；HFHS組TC顯著高于對照組(P<0.001)(表3)。發(fā)情間期HFHS組LH和E2水平顯著低于對照組(P<0.05)，T水平顯著高于對照組(P<0.001)(表4)。發(fā)情前期HFHS組LH和P水平顯著低于對照組(P<0.05)，T和E2水平顯著高于對照組(P<0.001)(表5)。

表1 兩組發(fā)情周期各階段在發(fā)情周期中的時間占比(-±s)

注：與對照組比較，*P<0.001

表2 兩組卵巢重量和卵巢組織形態(tài)學(xué)比較(-±s)

注：與對照組比較，*P<0.001

A：HFHS組；B對照組；Cyst：囊性卵泡；CL：黃體圖2 兩組卵巢組織形態(tài)學(xué)變化(HE染色 ×100)

組 別例數(shù)空腹血糖(mmol/L)空腹胰島素(mU/L)HOMA-IRTG(mmol/L)TC(mmol/L)對照組 187.73±0.3511.24±2.812.98±1.060.74±0.321.98±0.13HFHS組187.89±0.2829.21±3.99*8.87±2.96*0.57±0.212.30±0.21*

注：與對照組比較，*P<0.001

表4 兩組發(fā)情間期激素水平比較(-±s)

注：與對照組比較，*P<0.05，#P<0.001

表5 兩組發(fā)情前期激素水平比較(-±s)

注：與對照組比較，*P<0.05，#P<0.001

討 論

飲食誘導(dǎo)的肥胖與女性生殖疾病的發(fā)展密切相關(guān)。PCOS是一種以生殖障礙和代謝紊亂為特征的婦科疾病。PCOS患者往往體重過重，而且肥胖與PCOS存在一些合并癥。此外，飲食本身可能在PCOS發(fā)病機制中也發(fā)揮重要作用。本研究通過HFHS飲食誘導(dǎo)雌性大鼠肥胖和PCOS，探究HFHS飲食是否能導(dǎo)致PCOS及其相關(guān)的代謝紊亂和生殖特征。PCOS診斷的標(biāo)準(zhǔn)為無排卵、高雄激素血癥和多囊卵巢。本研究中，HFHS飲食的動物表現(xiàn)出無排卵、多囊卵巢。本研究中睪酮水平在發(fā)情前期和發(fā)情間期均升高，提示高雄激素血癥在此PCOS動物模型中也可能出現(xiàn)。與前人使用雄激素誘導(dǎo)的PCOS動物模型不同，本研究建立的PCOS模型或許更接近人類PCOS疾病病因?qū)W。

本研究中HFHS飲食對動物的生殖健康有明顯的影響。在動情周期監(jiān)測期間，HFHS飲食動物表現(xiàn)出異常發(fā)情周期，每日陰道涂片顯示這些動物已進(jìn)入持續(xù)角化狀態(tài)。而且HFHS動物在發(fā)情期持續(xù)時間比對照組長。這種無發(fā)情規(guī)律的無排卵狀態(tài)與PCOS患者一致，而且多項研究中也將陰道涂片持續(xù)角化狀態(tài)認(rèn)為是PCOS嚙齒動物不規(guī)則發(fā)情周期和無排卵的標(biāo)志物[6]。HFHS動物在發(fā)情間期和發(fā)情前期持續(xù)時間顯著比對照組短，表明這些動物的排卵活性降低。此外，HFHS飲食動物的卵巢結(jié)構(gòu)也發(fā)生了形態(tài)學(xué)變化。組織學(xué)分析顯示多囊卵巢的形成伴隨著黃體形成減少，表明排卵活性降低。黃體的形成減少與以前的嚙齒動物PCOS模型一致[7]。盡管兩組的卵巢重量無統(tǒng)計學(xué)差異，但HFHS動物組織中存在大量囊性卵泡，這一結(jié)果與以往PCOS動物模型的結(jié)果不同，其他多種PCOS動物模型中卵巢重量顯著增加[8]，這可能與HFHS飲食有關(guān)?？傊?，HFHS飲食不僅會導(dǎo)致動物進(jìn)入不規(guī)則的發(fā)情周期，其特征表現(xiàn)在發(fā)情期持續(xù)時間增加，而且還可通過影響卵泡發(fā)育來誘導(dǎo)卵巢結(jié)構(gòu)的變化。

本研究中HFHS組體重顯著高于對照組，且表現(xiàn)出高胰島素血癥，這類似于PCOS患者的代謝特征。HFHS可誘導(dǎo)高胰島素狀態(tài)具有重要意義，研究顯示胰島素水平升高可導(dǎo)致卵巢卵泡膜細(xì)胞的雄激素產(chǎn)生增加[9]。雄激素水平升高與無排卵有關(guān)[10]，并與異常卵泡成熟和加速大鼠卵泡閉鎖有關(guān)[11]。盡管過量的雄激素促進(jìn)了卵泡的早期生長，但它在發(fā)育的后期也誘導(dǎo)卵泡發(fā)育停滯[12]。雄激素過量可能是由于高胰島素血癥引起的胰島素信號傳導(dǎo)增加或卵巢內(nèi)類固醇生成改變引起的[13]。本研究中HFHS飲食誘導(dǎo)高胰島素血癥發(fā)生，且觀察到雄激素水平也增加，與前人研究一致[8]。睪酮水平升高可能是高胰島素血癥發(fā)展的繼發(fā)效應(yīng)，并在HFHS飲食誘導(dǎo)的PCOS的疾病發(fā)生發(fā)展中出現(xiàn)。在胰島素抵抗和高胰島素血癥動物中囊腫發(fā)生率高，睪酮水平升高，卵巢內(nèi)胰島素信號的增加可能導(dǎo)致卵巢形態(tài)改變和卵巢產(chǎn)生雄激素增加[14]。雖然PCOS患者可能發(fā)展成胰島素抵抗，但卵巢仍然對胰島素信號產(chǎn)生反應(yīng)以產(chǎn)生雄激素[15]。因此，睪酮水平的升高可能是胰島素誘導(dǎo)多囊卵巢形成的結(jié)果，而胰島素可能會導(dǎo)致或加速PCOS癥狀的出現(xiàn)。

受損的胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可能是高胰島素血癥的副產(chǎn)物，也與LH釋放有關(guān)。HFHS大鼠在發(fā)情前期LH顯著降低、E2顯著增加。E2水平異?？赡芘cLH波動的破壞有關(guān)。這可能表明排卵前期正反饋循環(huán)受損。本研究中HFHS大鼠發(fā)情前期P水平顯著降低。研究表明排卵前的P分泌對調(diào)節(jié)LH激增誘導(dǎo)的排卵至關(guān)重要[16]，提示P對LH分泌的反饋非常重要。大鼠排卵前P水平較低可能會阻止LH激發(fā)啟動排卵。因此，HFHS大鼠的卵巢形態(tài)改變可能是卵泡發(fā)育晚期激素失衡的結(jié)果。

總之，本研究通過HFHS飲食誘導(dǎo)雌性大鼠PCOS的特征，而非由外源激素誘導(dǎo)或通過改變類固醇生成途徑誘導(dǎo)，這提示HFHS飲食也可能誘導(dǎo)人PCOS，從而導(dǎo)致生殖健康受損及代謝紊亂。本研究為闡明肥胖與PCOS之間的潛在機制提供了一種可利用的動物模型。