許詠樂(lè)，王家雄，韓慕天，楊慎敏，王瑋，李紅

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院，蘇州市立醫(yī)院生殖與遺傳中心，蘇州 215002)

隨著輔助生殖技術(shù)(ART)的發(fā)展，女性患者的妊娠率得到了極大提高，但分娩率卻僅有20%左右，其重要原因之一是較高的流產(chǎn)率[1]。流產(chǎn)，尤其是反復(fù)流產(chǎn)困擾著眾多適孕年齡的女性，然而流產(chǎn)病因十分復(fù)雜，超過(guò)50%的病例病因不明[2]。已知病因可分為非免疫類(lèi)，如胚胎染色體或流產(chǎn)夫婦染色體異常、生殖道解剖異常、內(nèi)分泌異常和感染等病因，而另一類(lèi)，就是如今逐漸被大家重視的免疫因素引起的流產(chǎn)[3]。免疫因素流產(chǎn)還可以再被細(xì)分為自身免疫因素和同種異體免疫因素，自身免疫因素中最常見(jiàn)的就是抗磷脂綜合征(antiphosphoplipid syndrome，APS)，實(shí)驗(yàn)室常用的檢測(cè)指標(biāo)有：抗心磷脂抗體(anticardiolipin antibody，ACA)、抗β2糖蛋白1抗體(anti-β2 glycoprotein 1 antibody，anti-β2GP-1)、狼瘡抗凝因子(lupus anticoagulant，LAC)[4]。雖然臨床檢測(cè)按免疫分型將ACA與anti-β2GP-1檢測(cè)細(xì)分為IgA、IgM和IgG三種分型，但具體分型與流產(chǎn)的相關(guān)性研究很少報(bào)道，ACA與anti-β2GP-1具體分型與體外受精(IVF)結(jié)局的研究也鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)統(tǒng)計(jì)患者623個(gè)周期的ACA與anti-β2GP-1不同分型與臨床輔助生殖參數(shù)，探討這兩種抗體與流產(chǎn)以及IVF結(jié)局的關(guān)系。

資料與方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2016年6月至2017年12月在我院本部生殖與遺傳中心就診、因“不明原因不孕”行IVF治療的563對(duì)夫婦(共623個(gè)周期)的臨床資料。

二、研究方法

1. 常規(guī)IVF程序：促排卵采用本中心常規(guī)促排卵方案，凍融胚胎移植采用自然周期或人工周期準(zhǔn)備內(nèi)膜，選擇1～2個(gè)體外受精后第3或5天胚胎進(jìn)行移植，移植后常規(guī)黃體支持，移植日后12 d測(cè)外周血β-HCG，如β-HCG 陽(yáng)性者移植后35 d左右行陰道B超檢測(cè)確定臨床妊娠。

2. 分組：根據(jù)周期類(lèi)型，將樣本分為鮮胚移植周期組和凍融胚胎移植周期組，各組再根據(jù)所做的項(xiàng)目不同，分為 ACA IgA組、ACA IgM組、ACA IgG組與anti-β2GP-1 IgA組、anti-β2GP-1 IgM組、anti-β2GP-1 IgG組，觀察各項(xiàng)指標(biāo)與抗體數(shù)值的相關(guān)性。各組內(nèi)按其妊娠結(jié)局再分為妊娠失敗組、流產(chǎn)組與活產(chǎn)組，比較抗體數(shù)值組內(nèi)差異。

3. 觀察指標(biāo)：比較各組間年齡、不孕年限、體重指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)內(nèi)分泌等一般情況；對(duì)于鮮胚移植周期，觀察優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率等臨床指標(biāo)；對(duì)于凍融胚胎移植周期，著重觀察流產(chǎn)率、活產(chǎn)率等指標(biāo)。

4. ACA與Anti-β2GP-1測(cè)定：對(duì)入組的行IVF的患者在治療前抽外周血檢測(cè)ACA與Anti-β2GP-1，避免IVF治療過(guò)程對(duì)抗體數(shù)值的影響，ACA與Anti-β2GP-1測(cè)定均采用QUANTA Flash?試劑盒(Inova Diagnostics，美國(guó))，利用BIO-FLASH 儀器(Inova Diagnostics，美國(guó))，采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法對(duì)女方血清中的兩種抗體進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)前利用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定標(biāo)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般資料比較

各組間年齡、BMI、不孕年限、基礎(chǔ)FSH、基礎(chǔ)LH 、基礎(chǔ)E2、基礎(chǔ)T及基礎(chǔ)PRL均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

二、入選患者不同周期及不同結(jié)局分組抗體檢測(cè)數(shù)值比較

凍融胚胎移植周期患者的ACA IgM、IgG組及anti-β2GP-1 IgG組中，流產(chǎn)患者的抗體檢測(cè)數(shù)值均顯著高于其余兩組患者(P<0.05)；雖然鮮胚移植周期患者納入統(tǒng)計(jì)的周期數(shù)較少，但ACA IgG組和anti-β2GP-1 IgG組中的抗體檢測(cè)數(shù)值均顯著高于其余兩組(P<0.05)(表1、2)。

三、鮮胚移植周期患者輔助生殖參數(shù)與抗體檢測(cè)數(shù)值相關(guān)性分析

將抗體分型檢測(cè)數(shù)值與各項(xiàng)輔助生殖參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，ACA IgA與輔助生殖治療過(guò)程中的Gn持續(xù)天數(shù)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，而ACA IgG與獲卵數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，抗體數(shù)值與其他參數(shù)均無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)(表3)。

四、多因素Logistic回歸分析

以妊娠失敗為因變量，以女方年齡、男方年齡、不孕年限、平均獲卵數(shù)、女方BMI、ACA以及anti-β2GP-1為自變量做多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示女方年齡、男方年齡、不孕年限、獲卵數(shù)、女方BMI與流產(chǎn)的發(fā)生均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)；而ACA IgM、IgG以及anti-β2GP-1 IgG的升高對(duì)流產(chǎn)的發(fā)生有統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)(P<0.05)，即這三個(gè)指標(biāo)高時(shí)觀察到流產(chǎn)的概率較高(表4)。

表1 凍融胚胎移植周期患者的抗體分型檢測(cè)數(shù)值比較(-±s)

注：與同類(lèi)抗體其他組比較，*P<0.05

表2 鮮胚移植周期患者的抗體分型檢測(cè)數(shù)值比較(-±s)

注：與同類(lèi)抗體其他組比較，*P<0.05

表3 鮮胚移植周期患者的生殖參數(shù)與抗體檢測(cè)數(shù)值相關(guān)性分析(-±s)

注：與其他組比較，*P<0.05

表4 多因素Logistic回歸分析各因素對(duì)流產(chǎn)的影響

注：*P<0.05

討 論

抗磷脂抗體(anti-phospholipid antibodies，aPL)是一組能與多種含有磷脂結(jié)構(gòu)的抗原物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)的自身抗體，其中臨床檢測(cè)常用的為ACA和anti-β2GP-1。aPL與不孕癥的關(guān)聯(lián)假定在80年代首次被提出，時(shí)至今日，在沒(méi)有明顯的關(guān)聯(lián)或有效治療的情況下，該假定仍然存在很大的爭(zhēng)議[5]。最近一篇文獻(xiàn)評(píng)估了31項(xiàng)研究，統(tǒng)計(jì)了女性不孕與aPL的陽(yáng)性關(guān)聯(lián)，其中45%的研究證實(shí)了ACA陽(yáng)性與不孕之間的關(guān)聯(lián)，當(dāng)排除了LA測(cè)試結(jié)果的影響時(shí)，這一比率降低至31%，而只有4項(xiàng)研究評(píng)估了抗β2GP1抗體，3項(xiàng)報(bào)告其與不孕癥呈相關(guān)[6]。我們此次的研究針對(duì)行IVF治療的不孕女性，對(duì)ACA與Anti-β2GP-1的具體分型與IVF結(jié)局進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)凍融胚胎移植周期ACA IgM、IgG組，anti-β2GP-1 IgG組中，流產(chǎn)患者的抗體檢測(cè)數(shù)值均顯著高于其余兩組患者，而鮮胚移植周期ACA IgG組、anti-β2GP-1 IgG組中的抗體檢測(cè)數(shù)值均顯著升高。這一結(jié)果得到了國(guó)外研究的文獻(xiàn)支持，Qublan等[7]發(fā)現(xiàn)，相較于其他血栓形成因子，ACA和LA抗體在重復(fù)IVF失敗的女性中更常見(jiàn)。

雖然通過(guò)一系列的動(dòng)物模型試驗(yàn)，流產(chǎn)胎盤(pán)免疫檢測(cè)以及臨床隊(duì)列等研究已逐漸證實(shí)aPL可導(dǎo)致流產(chǎn)，但目前研究者們尚未確定aPL可能誘發(fā)流產(chǎn)以及不孕的精確病因機(jī)制[8]。對(duì)于不孕，一些專(zhuān)家假設(shè)aPL可能在分泌到卵泡液后破壞卵母細(xì)胞的發(fā)育，另一種理論設(shè)想aPL可能會(huì)干擾子宮蛻膜化，導(dǎo)致植入障礙并最終導(dǎo)致不孕[5]。但我們此次的研究未發(fā)現(xiàn)種植率與兩個(gè)免疫指標(biāo)的相關(guān)性。而對(duì)于aPL引發(fā)流產(chǎn)的機(jī)制，目前已有研究觀察到aPL在體外與子宮內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，損害血管生成[9]。同時(shí)體內(nèi)模型也獲得了aPL破壞蛻膜組織的證據(jù)，aPL IgG處理后的小鼠顯示出蛻膜壞死，同時(shí)伴有明顯的血管內(nèi)蛻膜IgG和纖維蛋白的沉積[10]。另外還有一些報(bào)告認(rèn)為血栓性紊亂在部分流產(chǎn)患者的病程中也起了重要作用[11]。體外實(shí)驗(yàn)證明，anti-β2GP-1能抑制內(nèi)源性的凝集通路及抑制血小板上的凝血酶原酶的活性，從而引起血栓，繼而引發(fā)流產(chǎn)[12]。

雖然此次研究沒(méi)有進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)ACA與anti-β2GP-1與其他輔助生殖參數(shù)的關(guān)系，但是有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)ACA IgG的數(shù)值與獲卵數(shù)呈負(fù)相關(guān)。迄今為止，關(guān)于APS女性生育率的研究中只有兩項(xiàng)評(píng)估了aPL陽(yáng)性和APS的女性卵巢儲(chǔ)備的關(guān)系[5]。2014年，一項(xiàng)橫斷面研究評(píng)估了18例APS女性和24例健康對(duì)照者的卵巢儲(chǔ)備，發(fā)現(xiàn)APS患者顯示出與對(duì)照受試者相似的AMH，F(xiàn)SH，LH和E2水平，但診斷為APS的女性，其竇卵泡超聲計(jì)數(shù)較低[13]，這與我們的數(shù)據(jù)相符。另一項(xiàng)研究則是發(fā)現(xiàn)ACA、anti-β2GP-1、LA與aPS的三種免疫分型與AMH存在顯著關(guān)聯(lián)，而AMH是卵巢儲(chǔ)備的重要標(biāo)志，從而間接推測(cè)aPL對(duì)卵巢儲(chǔ)備的影響。雖然此次我們還發(fā)現(xiàn)了ACA IgA對(duì)Gn持續(xù)天數(shù)的影響，但是這并未得到過(guò)往文獻(xiàn)的支持，其意義仍有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

anti-β2GP-1是臨床檢測(cè)免疫因素引發(fā)的流產(chǎn)的重要指標(biāo)，檢測(cè)其不同免疫分型可以避免漏篩隱匿性的自身免疫因素。此次研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于流產(chǎn)的預(yù)示作用，IgG分型似乎最好，IgM也有其重要作用，而IgA作為補(bǔ)充，預(yù)示作用不及另兩個(gè)免疫型，這從三種抗體免疫亞型的特征上也很好解釋。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，反復(fù)流產(chǎn)患者和不孕癥患者的ACA 多以IgG 和IgM 形式存在，IgM型ACA 患者易患血栓癥顯著高于IgG 型ACA 患者，若同時(shí)檢出ACA IgA，一般預(yù)示病情較重[14]。

目前雖然APS在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病例中所占比例僅為2%～15%左右[4]，但因其病因難以診斷，治療難以開(kāi)展，導(dǎo)致后果十分嚴(yán)重，必須引起臨床的高度重視。針對(duì)自身免疫引起的流產(chǎn)，臨床采用免疫抑制療法[3]和抗凝療法[15]，效果也較為理想，但仍有學(xué)者對(duì)其持保守態(tài)度，雖然此次我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以往的一樣，支持流產(chǎn)與aPL之間的關(guān)聯(lián)，但我們同樣認(rèn)為需要更多研究、更有說(shuō)服力的數(shù)據(jù)，通過(guò)國(guó)際診斷共識(shí)標(biāo)準(zhǔn)的確定或標(biāo)準(zhǔn)化核心實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的發(fā)布，進(jìn)一步的確定檢測(cè)和治療方案。