李玉娟， 孫欣欣， 李盼盼， 歐婉露， 屈鋒

(北京理工大學 生命學院，北京 100081)

中藥龍血竭作為一種名貴中藥材，是從百合科植物劍葉龍血樹Dracaenacochinchinensis(Lour.)S.C.Chen中提取得到的紅色樹脂，被譽為“活血圣藥”,主要分布于我國的云南省、廣西省等地區(qū). 現(xiàn)代研究顯示龍血竭具有活血、消炎、消腫等多種藥效[1-2], 其有效成分為酚類[3].以7,4′-二羥基黃酮(7,4′-dihydroxyflavanone,DHF)為代表的黃酮類；以白藜蘆醇(Resveratrol,RES)為代表的茋類；還有二氫查耳酮類，如龍血素A(Loureirin A,LA)、龍血素B(Loureirin B,LB)、龍血素C(Loureirin C,LC)等. 其化學結構如圖1所示. 研究發(fā)現(xiàn)，龍血竭可能通過影響體內(nèi)的凝血系統(tǒng)來發(fā)揮藥效[4]，但其是否直接作用于體內(nèi)凝血酶以及是否作用于凝血酶上的肝素結合位點等問題目前均未見報道.

圖1 LA、LB、LC、RES和DHF的化學結構Fig.1 Chemical structures of LA、LB、LC、RES and DHF

核酸適配體(aptamer,Apt)是單鏈的DNA或RNA分子，主要通過體外隨機的核苷酸文庫中篩選而獲得[5-7]. 核酸適配體與靶標之間的特性，類似于抗原抗體之間的作用，但是又有很多抗體無法比擬的優(yōu)勢. 由于核酸適配體與靶標之間能夠特異性結合，當核酸適配體與龍血竭有效成分也發(fā)生結合時，就會靶向轉運龍血竭有效成分，增加龍血竭的血藥濃度，從而發(fā)揮增強藥效的作用. 現(xiàn)在已成功篩選到了兩條凝血酶核酸適配體，其中一條由29個堿基(Apt29)構成，與凝血酶上的肝素結合位點高親和性的結合，發(fā)揮抑制蛋白活性的作用[8-10].

研究藥物分子與生物大分子間的相互作用對于深入闡明中藥的作用機理，在體內(nèi)的代謝過程以及配伍問題具有重要的意義，主要的分析技術有色譜法、光譜法、表面等離子體共振技術、毛細管電泳法等[11-14]，其中毛細管區(qū)帶電泳技術(capillary zone electrophoresis,CZE)被廣泛用于分析生物分子間相互作用. 目前未見有報道龍血竭有效活性分子與凝血酶及其核酸適配體之間相互作用的研究. 文中采用CZE法考察龍血竭有效單體與牛凝血酶(bovine thrombin,B-Thr)之間的相互作用，并對有效成分與核酸適配體之間的結合強弱進行研究.

1 實驗材料與方法

1.1 儀器和試劑

Agilent 7100毛細管電泳儀購自美國安捷倫科技有限公司. 實驗中采用的電泳分離通道是非涂層石英毛細管(內(nèi)徑75 μm；有效長度/總長度40/48.5 cm)購自河北鑫諾光纖有限公司.

龍血素A(LA)、龍血素B(LB)、龍血素C(LC)、7,4′-二羥基黃酮(DHF)、白藜蘆醇(RES)的對照品(純度>99.9%)，購自上海友思生物技術有限公司；29堿基凝血酶核酸適配體(Apt29)，購自上海生工生物工程有限公司；牛凝血酶(B-Thr)，購自美國Sigma公司；實驗用水為超純水.

1.2 溶液配制

1.2.1對照品儲備液

分別稱取LA、LB、LC、DHF、RES對照品適量，配制成質量濃度為1 g/L的LA、LB、LC、DHF、RES對照品儲備液. 實驗過程中用超純水稀釋并置于4 ℃冰箱保存.

1.2.2適配體和凝血酶溶液

按照產(chǎn)品說明書先將Apt29離心并用規(guī)定量蒸餾水溶解配成母液，用蒸餾水配制成濃度為100 μmol/L的B-Thr母液. 實驗過程中用超純水稀釋并置于4 ℃冰箱保存.

1.2.3樣品溶液

將龍血竭各有效單體分子分別與不同濃度的B-Thr溶液(或Apt29溶液)等體積混合，建立兩者的混合孵育體系，并于25 ℃水浴中孵育30 min 后，利用毛細管電泳儀對混合液進行進樣分析.

1.3 毛細管電泳條件

電泳運行緩沖液為pH8.5的Tris-HCl溶液(0.05 mol/L)，同時含10 mmol/L KCl；3.45 kPa氣壓進樣，進樣時間5 s，分離溫度15 ℃，分離電壓+15 kV，檢測龍血竭有效單體與B-Thr相互作用時，紫外波長設為214 nm，檢測與Apt29相互作用時，紫外波長設為330 nm.

1.4 結合常數(shù)計算方法

在研究化合物的相互作用過程中，通常用結合常數(shù)Kb來表示作用強弱. 特異性相互作用的Kb通過Scatchard方程[15]來計算，分子間相互作用較弱時的Kb以非特異性結合方程計算[16-17].

2 結果與討論

2.1 龍血竭有效單體與凝血酶之間結合作用的測定

分別將一定濃度龍血竭中的5種有效活性成分(LA、LB、LC、RES、DHF)溶液與不同濃度(0～25 μmol/L)的B-Thr混合，兩者如果發(fā)生結合作用，則會生成復合物，此時游離龍血竭單體成分的峰面積會降低，因此通過觀察混合樣品中游離龍血竭有效單體峰面積的變化，可以計算出兩者的結合常數(shù). 電泳圖如圖2所示.

隨著兩者混合體系中B-Thr濃度(1～25 μmol/L)的逐漸增加，LA峰面積逐漸降低，峰形穩(wěn)定,如圖2(a). 說明B-Thr在此濃度范圍內(nèi)，LA結合到B-Thr的活性位點上，發(fā)生了明顯的相互作用. 同樣考察龍血竭其余幾個有效單體與B-Thr之間的相互作用. 當B-Thr濃度(5～20 μmol/L)增加時，LB的峰面積幾乎不變，如圖2(b). 即游離LB的濃度幾乎不變，說明LB與B-Thr沒有結合作用. 不斷增加混合體系中B-Thr的濃度(1～10 μmol/L)，從電泳圖譜中統(tǒng)計得到化合物LC的峰面積數(shù)據(jù)沒有明顯減小的趨勢，如圖2(c). 但是峰形出現(xiàn)了微弱的展寬,這些現(xiàn)象說明化合物LC與B-Thr之間結合作用非常微弱，推測當藥物進入體內(nèi)后，大部分并未結合到凝血酶的活性位點. 化合物RES的峰面積隨著混合體系中B-Thr濃度的增加也沒有出現(xiàn)下降趨勢,如圖2(d). 說明RES跟B-Thr混合后仍以游離態(tài)存在，并未與B-Thr發(fā)生結合作用. 當B-Thr濃度(1.0～7.5 μmol/L)增加時，DHF的峰面積沒有明顯變化,如圖2(e). DHF的游離濃度沒有明顯改變，說明DHF與B-Thr沒有結合作用. 通過用Scatchard方程和非特性結合方程計算得到LA和B -Thr之間的結合常數(shù)Kb為4.73×104L/mol.

圖2 LA、LB、LC、RES及DHF與不同濃度(0～25 μmol/L)B-Thr孵育后化合物的毛細管電泳圖Fig.2 CE chromatograms of LA、LB、LC、RES and DHF incubated with different concentration B-Thr (0～25 μmol/L)

綜合以上實驗結果，龍血竭中的5種主要活性成分與凝血酶的結合作用過程中，同屬于二氫查耳酮類的龍血素A、龍血素B、龍血素C，只有龍血素A表現(xiàn)出了結合作用，推測LA進入體內(nèi)后會與凝血酶上的活性位點結合，發(fā)揮其藥效. 其余的幾種化合物仍然以游離狀態(tài)存在，未結合到凝血酶分子中. 對比三者的化學結構可以看出，LB、LC分子中B環(huán)上2位和4位上取代基的類型對化合物與凝血酶的結合作用可能產(chǎn)生重要影響. LA分子的構象更加適應與B-Thr結合位點的嵌合. 可見，化合物苯環(huán)上取代基的類型以及所在苯環(huán)中的位置對結合起重要作用.

2.2 龍血竭有效單體與Apt29之間結合作用的測定

分別將一定濃度的龍血竭中5種主要活性成分與不同濃度(0～40 μmol/L)的Apt29溶液混合孵育后，利用毛細管區(qū)帶電泳技術測定混合樣品中游離龍血竭有效單體濃度,如圖3所示.

圖3 LA、LB、LC、RES及DHF與不同濃度(0～40 μmol/L)Apt29孵育后化合物的毛細管電泳圖Fig.3 CE chromatograms of LA、 LB、LC、RES and DHF incubated with different concentration Apt29 (0～40 μmol/L)

隨著Apt29濃度(10～30 μmol/L)增加，電泳圖中對LA峰面積進行積分，在凝血酶5個濃度梯度下游離LA峰面積幾乎保持不變,如圖3(a)，說明LA與Apt29之間沒有發(fā)生結合作用. LB峰面積隨著兩者混合體系中Apt29濃度(5～40 μmol/L)依次增加而出現(xiàn)明顯降低趨勢,如圖3(b)，說明LB與Apt29有結合作用. 隨著體系中Apt29濃度梯度(6～30 μmol/L)依次增加，LC的峰面積沒有發(fā)生明顯變化,如圖3(c)，說明LC與Apt29沒有結合作用. 隨著Apt29濃度(10～30 μmol/L)增加，RES峰面積幾乎不變,如圖3(d)，峰形穩(wěn)定，化合物RES與Apt29之間也未發(fā)生結合現(xiàn)象. 在藥物與核酸適配體的混合體系中，依次增加Apt29濃度(6～30 μmol/L)，DHF峰面積出現(xiàn)降低趨勢且變成鈍峰,如圖3(e)，說明此濃度范圍內(nèi)DHF與Apt29之間產(chǎn)生了明顯相互作用.

用Scatchard方法計算LB、DHF與Apt29之間的結合常數(shù)時,所得曲線斜率為正，同樣用非特異性結合方程計算各單體與Apt29的結合常數(shù). 龍血素B、DHF與Apt29之間的結合常數(shù)Kb分別為1.98×104L/mol和1.83×104L/mol.

龍血竭中幾個化合物分子與核酸適配體之間同樣也表現(xiàn)出了一定的結合作用，這對于揭示核酸適配體攜帶藥物的能力提供一定參考. 比較LA、LB的化學結構，LB在苯環(huán)B環(huán)6位上增加了一個—OCH3，使LB與Apt29之間發(fā)生了結合作用，說明苯環(huán)B環(huán)6位上的—OCH3可能與Apt29上的親電子基團發(fā)生靜電結合作用. LA、LC與Apt29均沒有顯著的結合，說明苯環(huán)B環(huán)上4位的—OH或—OCH3取代對藥物分子和Apt29之間的結合沒有產(chǎn)生影響. DHF與Apt29之間也有結合作用，說明黃酮類的平面共軛結構也是藥物分子與能形成G四鏈體結構的核酸(quadruplexDNA)分子結合的一個因素.

3 結 論

文中采用毛細管區(qū)帶電泳法研究了龍血竭中的LA、LB、LC、RES、DHF與牛凝血酶以及29堿基凝血酶核酸適配體之間的相互作用. 結果表明，LA與牛凝血酶之間為非特異性結合，結合常數(shù)Kb為4.73×104L/mol. LB、DHF與Apt29之間是非特異性結合，結合常數(shù)分別為1.98×104L/mol和1.83×104L/mol. 這種結合作用大小或與化合物苯環(huán)上取代基團的位置、種類、數(shù)量等因素有關. 研究中藥龍血竭與凝血酶及適配體之間的結合作用，有助于闡明龍血竭在體內(nèi)的藥效學規(guī)律，從而指導中藥的合理用藥發(fā)揮重要影響. 研究結果對于揭示龍血竭有效單體是否直接作用于凝血酶而發(fā)揮藥效，以及凝血酶核酸適配體能否作為龍血竭的轉運體以實現(xiàn)定向轉運提供基礎數(shù)據(jù)參考.