舒順順，米倩，楊彩霞，劉芹，牛軍

（正大食品（襄陽）有限公司，湖北襄陽441000）

在我國，養(yǎng)殖業(yè)抗生素濫用問題一直比較嚴(yán)重。在養(yǎng)豬業(yè)不僅用抗生素治療疾病，還用來防治疾病[1]。濫用抗生素，將導(dǎo)致豬體內(nèi)抗生素殘留，不僅會(huì)給豬肉食品安全帶來潛在隱患，更會(huì)對人類的健康及生存環(huán)境造成危害[2]。氯霉素和地塞米松是抗生素殘留中的重要成員。

氯霉素（chloramphenicol，CAP）是由委內(nèi)瑞拉鏈絲菌產(chǎn)生的，可作用于細(xì)菌核糖核蛋白體的50S亞基，抑制菌體蛋白合成，對革蘭式陰性菌和革蘭氏陽性菌均有抑制作用，屬抑菌性廣譜抗生素[3]。由于價(jià)格低廉且效果顯著，常被作為畜禽的疾病治療和預(yù)防[4]。地塞米松（dexamethasone，DXMS）于 1957 年首次合成，是一種人工合成的皮質(zhì)類固醇。其藥理作用主要是抗炎、抗毒、抗過敏、抗風(fēng)濕等[5]。經(jīng)過長時(shí)間的臨床應(yīng)用實(shí)踐，人們對氯霉素和地塞米松的毒副作用有了充分的認(rèn)識(shí)。氯霉素的毒副作用主要有：抑制骨髓造血功能，引起新生兒致命性灰色綜合癥，以及引起精神抑郁厭食等，低濃度藥物殘留還會(huì)誘發(fā)致病菌的耐藥性[6]。地塞米松的毒副作用主要有：可能導(dǎo)致全身性過敏反應(yīng)、骨質(zhì)疏松及骨折、腸胃道刺激（惡心、嘔吐）、兒童生長受到抑制、誘發(fā)青光眼白內(nèi)障、可能出現(xiàn)精神癥狀、停藥綜合癥等危害[7]。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是對抗生素定量時(shí)常用的方法[8]，此法的定量方法分為外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法[9-10]。外標(biāo)法是用待測組分的純品作對照物質(zhì)，以對照物質(zhì)和樣品中待測組分的響應(yīng)信號相比較進(jìn)行定量的方法；此方法簡便，無需校正因子，不論樣品中其他組分是否出峰，均可對待測組分定量，適用范圍較廣。內(nèi)標(biāo)法是選擇樣品中不含有的純物質(zhì)作為對照物質(zhì)加入待測樣品溶液中，以待測組分和對照物質(zhì)的響應(yīng)信號對比，測定待測組分含量的方法；此測定的結(jié)果較為準(zhǔn)確，由于是通過測量內(nèi)標(biāo)物及被測組分的峰面積的相對值來進(jìn)行計(jì)算的，因而在一定程度上消除了操作條件等的變化所引起的誤差，適用于對精密度和準(zhǔn)確度要求較高的物質(zhì)的檢測。由于氯霉素對精密度（GB/T 22338-2008《動(dòng)物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定》要求：添加濃度為 0.1 μg/kg～5 μg/kg，回收率范圍為80.5%～107.0%）要求比較高，而地塞米松對精密度（農(nóng)業(yè)部1031號公告-2-2008要求：添加濃度為0.5 μg/kg～1.5μg/kg，回收率范圍為 50%～120%）要求寬泛，所以本研究中用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肉中氯霉素時(shí)采用內(nèi)標(biāo)法，測定地塞米松時(shí)采用外標(biāo)法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯霉素（CAP，≥99.3%）、氯霉素氘代內(nèi)標(biāo)（氯霉素-D5，100 mg/mL）、地塞米松（DXMS，≥98.9%）：德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；乙酸乙酯（色譜純）、正己烷（色譜純）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：德國默克股份兩合公司；試驗(yàn)用水均為超純水。

豬肉：正大食品（襄陽）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TURBOVA LV全自動(dòng)水浴氮吹儀：美國BIOTAGE公司；LC-MS/MS 8040高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：日本島津公司；VORTEX3迷你振蕩器：德國IKA公司；GL-21高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；一次性注射器（1 mL）：湖南康利來醫(yī)療器械有限公司；500 mg/6mL Silica固相萃取柱、疏水性PTFE針式濾器（0.22 μm）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

1）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配置

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確到 0.1 mg），用甲醇定容到 100 mL，配成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

氯霉素氘代內(nèi)標(biāo)（氯霉素-D5）儲(chǔ)備溶液：100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（4℃避光保存可使用12個(gè)月）。

地塞米松標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取地塞米松標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確到0.1 mg），用甲醇定容到10 mL，配成1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（-20℃保存可使用12個(gè)月）。

2）中間儲(chǔ)備溶液的配置

用移液器分別移取1 mL氯霉素、氯霉素-D5、地塞米松儲(chǔ)備液，用甲醇定容至10 mL，再按照10倍稀釋度逐步分別配成濃度為1 μg/mL的中間儲(chǔ)備液。

3）工作液配置

分別移取氯霉素中間儲(chǔ)備液、氯霉素-D5中間儲(chǔ)備液、地塞米松中間儲(chǔ)備液各1mL到3個(gè)5mL容量瓶中，用甲醇分別定容到5 mL，配制成200 ng/mL的工作液。

試驗(yàn)中用甲醇配置混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，氯霉素和地塞米松標(biāo)準(zhǔn)品終濃度均為 0.2、0.5、2、5、10、20、40 ng/mL；氯霉素-D5終濃度為10 ng/mL。

1.3.2 色譜、質(zhì)譜條件

1）液相色譜條件

島津Shim-packGISTC18色譜柱（150mm×2.1mm，5 μm），柱溫箱溫度：40℃，流速：0.3 mL/min，進(jìn)樣體積：20 μL，流動(dòng)相：水（A）-甲醇（B）。梯度洗脫程序如下：0～0.5 min，25%B；0.5 min～2 min，25%B～100%B；2 min～4 min，100%B；4 min～5 min，100%B～25%B；5 min～8 min，25%B。

2）質(zhì)譜條件

檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitor ing，MRM），加熱模塊溫度：400℃，干燥器氣流（drying gas flow）：15.0 L/min，霧化器氣流（nebulizing gas flow）：3.0 L/min，碰撞氣：氬氣，壓力（CID Gas）：230 kPa，離子源：電噴霧離子源（electrospray ion source，ESI+），掃描方式：負(fù)離子掃描。

1.3.3 樣品前處理

1.3.3.1 提取

取新鮮或冷凍豬肉，去除表觀脂肪，攪碎，準(zhǔn)確稱量樣品2.00 g于50 mL離心管中，各樣品管中加入氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液50 μL，加標(biāo)回收管再加入相應(yīng)體積的外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。各管加乙酸乙酯15 mL，渦旋混合 5 min，4 000 r/min 離心 15 min，將乙酸乙酯層轉(zhuǎn)移到另一個(gè)50 mL離心管中；殘?jiān)?5 mL乙酸乙酯重復(fù)提取1次，合并2次樣品提取液，40℃氮?dú)獯蹈?，? mL乙酸乙酯和5 mL正己烷，溶解殘?jiān)?，待凈化?/p>

1.3.3.2 凈化

用6 mL正己烷活化固相萃取柱，提取液過柱。用6 mL正己烷淋洗萃取柱，抽干，用6 mL正己烷-丙酮（6∶4，體積比）洗脫，用10 mL離心管收集洗脫液。洗脫液45℃氮?dú)獯蹈?，?5%甲醇水溶液1 mL，溶解殘?jiān)?0 000 r/min離心20 min，用1 mL注射器取上清液，過0.22 μm有機(jī)濾膜，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定。

1.3.4 試驗(yàn)方法

氯霉素采用內(nèi)標(biāo)法，以氯霉素-D5為內(nèi)標(biāo)物測定氯霉素含量；地塞米松采用外標(biāo)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

選用負(fù)離子全掃描方式，采用Q3 Scan模式進(jìn)行一級質(zhì)譜分析，得到各個(gè)被測物分子離子峰，掃描圖譜如圖1。

根據(jù)分子離子峰，確認(rèn)氯霉素、氯霉素-D5和地塞米松的m/z值分別為321.10、326.10和437.15。以3種化合物確認(rèn)的m/z值為母離子，進(jìn)行二級質(zhì)譜分析及自動(dòng)優(yōu)化，得到質(zhì)譜參數(shù)見表1。

圖1 3種化合物全掃描圖譜Fig.1 The full scan map of the three compounds

表1 氯霉素和地塞米松的質(zhì)譜條件參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters of chloramphenicol and dexamethasone

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)相選擇

氯霉素易溶于甲醇、乙醇、丙醇及乙酸乙酯，在干燥時(shí)穩(wěn)定，在弱酸性和中性溶液中較安定，遇堿類易失效[7]；地塞米松在丙酮、甲醇、乙醇或二氧六環(huán)中略溶，在三氯甲烷中微溶，在乙醚中極微溶解，在水中幾乎不溶[7]。因此選用不同的流動(dòng)相對氯霉素和地塞米松的溶解性差別較大，這將直接影響檢測的信號強(qiáng)度。本研究采用4組流動(dòng)相進(jìn)行檢測，分別為純水-甲醇、0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇、純水-乙腈、0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈，對同一混合標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液進(jìn)行檢測，以純水-甲醇為流動(dòng)相時(shí)3種化合物峰面積為1，對比結(jié)果如圖2。

試驗(yàn)表明，氯霉素和氯霉素-D5在以純水-甲醇為流動(dòng)相時(shí)響應(yīng)最高，在以0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈為流動(dòng)相時(shí)響應(yīng)最低，僅為最高響應(yīng)值的0.27倍和0.26倍；地塞米松在以0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇為流動(dòng)相時(shí)響應(yīng)最高，為純水-甲醇作為流動(dòng)相時(shí)的1.34倍。綜合考慮，本研究采用純水-甲醇作為流動(dòng)相。

圖2 流動(dòng)相對離子化效率的影響Fig.2 Effect of mobile phase on ionization efficiency

2.2.2 梯度洗脫程序優(yōu)化

圖3 氯霉素和地塞米松標(biāo)準(zhǔn)溶液離子色譜圖Fig.3 Ion chromatograms of chloramphenicol and dexamethasone in standard solution

選用純水-甲醇為流動(dòng)相優(yōu)化梯度洗脫程序，在上述液相色譜條件和質(zhì)譜條件下，氯霉素（0.2 ng/mL）出峰時(shí)間為4.20 min，地塞米松（0.2 ng/mL）出峰時(shí)間為4.52 min，氯霉素和地塞米松能夠良好分離，如圖3。

2.2.3 提取條件的選擇

本研究對豬肉樣品分別采用乙腈和乙酸乙酯進(jìn)行提取，結(jié)果見表2。

表2 乙腈和乙酸乙酯提取時(shí)氯霉素和地塞米松的回收率Table 2 Recoveries of chloramphenicol and dexamethasone using acetonitrile and ethyl acetate

乙腈和乙酸乙酯提取對氯霉素回收率沒有顯著差別（P＞0.05），地塞米松用乙酸乙酯提取時(shí)回收率顯著（P＜0.05）高于用乙腈提取。因此本研究采用乙酸乙酯作為提取劑。

2.3 線性范圍和定量限

選用優(yōu)化的色譜條件、質(zhì)譜條件和前處理?xiàng)l件，對系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，得到氯霉素和地塞米松標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中氯霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線橫坐標(biāo)為系列濃度，縱坐標(biāo)為氯霉素峰面積與氯霉素-D5峰面積的比值，地塞米松標(biāo)準(zhǔn)曲線橫坐標(biāo)為系列濃度，縱坐標(biāo)為峰面積。以10倍信噪比確定兩種化合物的定量限，相關(guān)參數(shù)如表3。

表3 氯霉素、地塞米松的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和定量限Table 3 Linear equations，correlation coefficients and limits of quantitation of chloramphenicol and dexamethasone

2.4 回收率和精密度

選取陰性豬肉樣品，稱取15份隨機(jī)分成3組，第一組氯霉素添加量為1μg/kg，地塞米松添加量為0.5μg/kg；第二組和第三組氯霉素和地塞米松的添加量相同，兩組添加量分別為2.5 μg/kg和5 μg/kg。批間精密度是在5 μg/kg的添加水平上進(jìn)行5個(gè)樣品分析，連續(xù)測定3 d，結(jié)果見表4。

表4 陰性豬肉中添加氯霉素和地塞米松的加標(biāo)回收率和精密度Table 4 Spiked recoveries and RSDs of chloramphenicol and dexamethasone in pork samples

結(jié)果表明，豬肉中氯霉素3個(gè)添加水平的平均回收率在90.54%～101.73%之間，批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值在2.3%～7.6%之間，批間標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為8.95%；豬肉中地塞米松3個(gè)添加水平的平均回收率在83.82%～87.50%之間，批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值在2.5%～9.5%之間，批間標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為8.03%。

2.5 實(shí)際樣品的檢測

應(yīng)用本方法對50個(gè)豬肉樣品同時(shí)進(jìn)行氯霉素和地塞米松的檢測，未發(fā)現(xiàn)陽性樣品。

3 結(jié)論

本研究建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測豬肉中氯霉素和地塞米松殘留的方法。根據(jù)精密度要求不同，氯霉素采用內(nèi)標(biāo)法定量而地塞米松采用外標(biāo)法定量。通過優(yōu)化質(zhì)譜條件、色譜條件，使氯霉素和地塞米松在響應(yīng)強(qiáng)度增強(qiáng)的同時(shí)能夠很好的分離；通過優(yōu)化提取溶劑，使地塞米松的回收率顯著提高；兩種藥物殘留一同檢測，使分析時(shí)間成倍縮短，節(jié)約時(shí)間和成本。該方法回收率高、重復(fù)性好，氯霉素添加量在1 μg/kg～5 μg/kg時(shí)，回收率在 90.54%～101.73%之間；地塞米松添加量在 0.5 μg/kg～5 μg/kg 時(shí)，回收率在83.82～87.5%之間；批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差和批間標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%值均小于10。因此，該方法是一種快速、準(zhǔn)確、靈敏、實(shí)用的方法，完全滿足國內(nèi)外對豬肉中氯霉素和地塞米松藥物殘留的檢測要求。