（天津海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，天津300456）

孔雀石綠（malachite green，MG）和結(jié)晶紫（crystal violet，CV）均屬于三苯甲烷類工業(yè)染料，由于其可以作為殺菌劑用于控制魚類或魚卵的寄生蟲、真菌和細(xì)菌感染，早期在水產(chǎn)養(yǎng)殖上用來預(yù)防和治療水產(chǎn)動(dòng)物的鰓霉病、水霉病和水體環(huán)境消毒[1-2]。它們?cè)诒霍~類吸收后，大部分會(huì)快速地轉(zhuǎn)化為隱色孔雀石綠（leucomalachite green，LMG）和隱色結(jié)晶紫（leucocrystal violet，LCV），代謝物由于其具有很好的親脂性，因而在魚類的脂肪組織中會(huì)形成比較穩(wěn)定的殘留[2]。研究表明，此類藥物具有致癌、致畸、致突變等副作用[3]，歐盟、美國、日本以及我國等均宣布禁止其在水產(chǎn)品養(yǎng)殖過程中使用。但由于其價(jià)格低廉、效果顯著，且尚無更好的替代品，所以在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的使用屢禁不止。

目前國內(nèi)外孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝產(chǎn)物的方法主要有高效液相色譜法（high performancy liquit chromatography，HPLC）[4-5]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（high performancy liquit chromatography-mass tande mass spectrometry，HPLC-MS/MS）[6-11]等。HPLC 方法前處理步驟復(fù)雜，檢測(cè)靈敏度不高，且容易出現(xiàn)干擾，需要進(jìn)一步的確證；HPLC-MS/MS方法前處理復(fù)雜，且水產(chǎn)樣品基質(zhì)復(fù)雜，容易產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)。在線凈化技術(shù)是針對(duì)質(zhì)譜分析的高級(jí)在線復(fù)雜基質(zhì)樣品萃取技術(shù)，結(jié)合了擴(kuò)散、化學(xué)和體積排除的原理，在捕獲目標(biāo)化合物的同時(shí)能夠快速凈化樣品[12-14]。堵燕鈺等[15]采用Turboflow在線凈化技術(shù)與HPLC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)水產(chǎn)品中孔雀石綠及隱性孔雀石綠的殘留，但未對(duì)結(jié)晶紫及隱色結(jié)晶紫殘留進(jìn)行研究。本研究是對(duì)在線凈化技術(shù)的改進(jìn)，通過兩根不同凈化柱的串聯(lián)使用，進(jìn)一步提高了復(fù)雜樣品的凈化效果。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

TSQ Quantum Ultra AM三重四極質(zhì)譜儀、Turboflow在線液相色譜系統(tǒng)（包括兩個(gè)Transcend 600泵和CTC多功能進(jìn)樣器）、Aria OS及Xcalibur操作軟件：美國Thermo Fisher公司；Waters 515液相泵：美國Waters公司；08895-67型超聲波提取儀：美國 Cole Parmer公司；CR22高速離心機(jī)：日本日立公司；MILLI-Q純水器：美國Millipore公司。

1.1.2 試劑

甲醇、乙腈和甲酸（HPLC純）：美國Dikma公司；醋酸銨（色譜純）：天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；孔雀石綠（MG，純度≥99%）、結(jié)晶紫（CV，純度≥99%）、隱身孔雀石綠（LMG，純度≥99%）、隱色結(jié)晶紫（LCV，純度≥99%）、同位素內(nèi)標(biāo)孔雀石綠-d5（MG-d5，純度≥99%），同位素內(nèi)標(biāo)隱色孔雀石綠-d6（LMG-d6，純度≥99%）：美國Biopure公司。

儲(chǔ)備液及工作液的配制：用乙腈將各固體標(biāo)準(zhǔn)品配制為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。取各儲(chǔ)備液適量，用乙腈將儲(chǔ)備液配制為1.0 μg/mL的混合工作液。

內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液及工作液的配制：用乙腈將MG-d5和LMG-d6標(biāo)準(zhǔn)品配制為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。取各儲(chǔ)備液適量，用乙腈將儲(chǔ)備液配制為1.0 μg/mL的混合中間液和0.1 μg/mL混合內(nèi)標(biāo)工作液。

1.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用針泵連續(xù)進(jìn)樣的方式，在正離子模式（ESI+）下，先對(duì)各個(gè)目標(biāo)物進(jìn)行母離子全掃描，然后對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描，分別選定定性離子和定量離子，并對(duì)噴霧電壓、離子源溫度、鞘氣、輔助氣、離子透鏡電壓等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

1.3 雙柱在線凈化原理

雙柱在線凈化技術(shù)通過柱切換實(shí)現(xiàn)樣品的兩步凈化與測(cè)定一體化。主要包括3步：上樣、一維凈化、轉(zhuǎn)移、二維凈化、轉(zhuǎn)移、測(cè)定，其中測(cè)定的同時(shí)包括在線凈化柱的清洗與平衡。上樣與測(cè)定步驟柱連接方式相同。圖1為上樣和測(cè)定過程的示意圖，圖2、圖3分別為轉(zhuǎn)移過程示意圖，圖中A、B、C和D分別表示不同的洗脫溶劑。

1.4 雙柱在線凈化方法優(yōu)化

根據(jù)孔雀石綠等藥物性質(zhì)，優(yōu)化選擇一維凈化柱，試驗(yàn)不同上樣溶液及洗脫溶液對(duì)藥物的富集效果。一維富集后，藥物洗脫至二維凈化柱，優(yōu)化選擇二維凈化柱類型，選擇適當(dāng)活性的萃取柱，試驗(yàn)不同洗脫溶劑的洗脫效果。

1.5 色譜條件優(yōu)化

圖1 上樣和測(cè)定過程示意圖Fig.1 Schematic diagram of loading and detecting

根據(jù)優(yōu)化選擇不同的流動(dòng)相，使各藥物質(zhì)譜響應(yīng)最佳。優(yōu)化梯度洗脫程序，使各化合物峰形尖銳，對(duì)稱。

圖2 轉(zhuǎn)移至二維凈化過程示意圖Fig.2 Schematic diagram of transferring to the second cleanup-column

圖3 轉(zhuǎn)移至分析柱凈化過程示意圖Fig.3 Schematic diagram of transferring to analysis column

1.6 基質(zhì)工作曲線的繪制

以空白樣品提取液，分別加入孔雀石綠等藥物混標(biāo)工作液以及內(nèi)標(biāo)工作液適量，配制系列標(biāo)準(zhǔn)基質(zhì)溶液（0.1、0.2、0.5、1、2 ng/mL，內(nèi)標(biāo)為 1 ng/mL）進(jìn)行測(cè)試，以藥物濃度為橫坐標(biāo)，藥物與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)（孔雀石綠-d5作為孔雀石綠和結(jié)晶紫的內(nèi)標(biāo)，隱色孔雀石綠-d6作為隱形孔雀石綠和隱色結(jié)晶紫的內(nèi)標(biāo)），繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.7 樣品處理方法優(yōu)化

優(yōu)化建立與在線凈化相適應(yīng)的前處理方法，樣品經(jīng)簡單的溶劑提取過濾后直接上機(jī)測(cè)定。比較不同溶劑的提取效果，以空白樣品添加一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以絕對(duì)回收率評(píng)價(jià)提取效果。

1.8 加標(biāo)回收試驗(yàn)

以未檢測(cè)出孔雀石綠等藥物的魚肉作為空白基質(zhì)，加入標(biāo)準(zhǔn)混合溶液及內(nèi)標(biāo)，選擇優(yōu)化后的前處理?xiàng)l件和儀器條件，上機(jī)檢測(cè)，計(jì)算回收率。

1.9 儀器條件

1.9.1 色譜條件

表1 雙柱在線凈化系統(tǒng)洗脫程序表Table 1 Elution program of positive electrospray ionization

一維凈化柱為Cyclone MCX（50 mm×0.5 mm），上樣溶劑為0.1%甲酸水溶液，洗脫溶液為乙腈-丙酮-氨水（47.5+47.5+5，體積比），洗脫流速 0.4 mL/min。二維凈化柱為C8XL（50 mm×0.5 mm），上樣溶劑為0.1%甲酸水溶液，洗脫溶液為1%氨水甲醇溶液，洗脫流速0.3 mL/min。分析柱為Atlantis dC18色譜柱（150 mm×2.1mm，3μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液（含有0.01mol/L甲酸氨）+乙腈，洗脫程序見表1。進(jìn)樣量100 μL（每次進(jìn)樣 25 μL，共 4 次，計(jì) 100 μL），外標(biāo)法定量。

續(xù)表1 雙柱在線凈化系統(tǒng)洗脫程序表Continue table 1 Elution program of positive electrospray ionization

1.9.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），正離子模式，噴霧電壓設(shè)定為3 000 V，噴霧加熱器溫度350℃，離子傳輸管溫度300℃，鞘氣壓力8 750 kPa，輔助氣壓力2 625 kPa。

采用選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（selective reaction monitoring，SRM）采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，質(zhì)譜條件分別見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

1.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液直接泵入質(zhì)譜，在ESI+模式進(jìn)行一級(jí)全掃描，調(diào)節(jié)噴霧電壓、鞘氣、輔助氣、離子透鏡電壓等質(zhì)譜條件，獲得豐度較高的各化合物準(zhǔn)分子離子峰，優(yōu)化各母離子的離子透鏡電壓。以其作為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，選取響應(yīng)信號(hào)最強(qiáng)的兩個(gè)特征碎片離子，作為子離子，較高的作為定量離子，次之的為定性離子，優(yōu)化子離子碰撞能量，最終優(yōu)化后質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2.2 雙柱在線凈化系統(tǒng)優(yōu)化

2.2.1 一維凈化柱的操作條件優(yōu)化

孔雀石綠等藥物為陽離子藥物，同時(shí)其極性較弱，因此其在陽離子交換柱（MCX）和反相C18或C8上都有較好的保留。由于MCX作用機(jī)理主要是離子交換，其抗干擾能力和選擇性由于反相凈化柱。因此選擇MCX作為一維凈化柱。

上樣溶劑選擇0.1%甲酸水最為方便，酸性條件有利于孔雀石綠等藥物在凈化柱上的保留。純水作為上樣溶劑經(jīng)過洗脫后，活性無法完全恢復(fù)，影響孔雀石綠等藥物的吸附。

MCX作為離子交換柱，洗脫溶劑需要一定濃度的氨水，且由于孔雀石綠等藥物極性較弱，洗脫溶劑極性需要調(diào)節(jié)適當(dāng)。洗脫溶劑試驗(yàn)了甲醇-氨水體系，乙腈-氨水體系，乙腈-丙酮-氨水體系，采用乙腈-丙酮-氨水體系時(shí)結(jié)晶紫和隱色結(jié)晶紫洗脫峰尖銳，其他溶劑體系洗脫能力不夠，最終優(yōu)化采用乙腈-丙酮-氨水（47.5+47.5+5，體積比）作為一維凈化柱的洗脫溶劑。

2.2.2 二維凈化柱的操作條件優(yōu)化

孔雀石綠等藥物經(jīng)一維MCX柱凈化后轉(zhuǎn)移至二維凈化柱，進(jìn)一步富集凈化。二維凈化柱選擇與一維凈化柱不同凈化機(jī)理的有助于進(jìn)一步去除干擾，因此二維凈化柱選擇反相柱。由于反相C18或C8上都有較好的保留，試驗(yàn)優(yōu)化了 HLB、C18P、C18XL、C8XL 等反相凈化柱，發(fā)現(xiàn)各凈化柱對(duì)結(jié)晶紫和隱色結(jié)晶紫吸附能力為HLB>C18P>C18XL>C8XL，由于二維凈化柱洗脫液進(jìn)入分析柱，需要該凈化柱適當(dāng)保留即可，洗脫液洗脫能力過大將影響分析柱上的保留及洗脫，最后導(dǎo)致峰形較差，影響定量。因此選擇C8XL作為二維凈化柱。

C8XL凈化柱的洗脫液可使用機(jī)溶劑，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)一定濃度的氨水可以提高洗脫能力，避免使用極性較弱的溶劑影響孔雀石綠等藥物在分析柱上的保留。洗脫溶劑要求極性越強(qiáng)越好，氨水比例越低越好，經(jīng)優(yōu)化1%的氨水-甲醇即可完成C8XL柱的洗脫。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

為獲得良好的峰形，最佳的質(zhì)譜響應(yīng)，考察了甲酸溶液、甲酸氨-甲酸溶液分別作為水相，甲醇、乙腈分別作為有機(jī)相，試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)現(xiàn)采用甲酸氨-甲酸溶液+乙腈作為流動(dòng)相，梯度洗脫，各化合物峰形最尖銳，且質(zhì)譜響應(yīng)最佳。

流動(dòng)相起始比例為95%水相，用于稀釋轉(zhuǎn)移至分析柱的高比例有機(jī)相及中和氨水，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移過程中各藥物無不保留流出情況，梯度洗脫，逐漸增加有機(jī)相比例，各藥物依次洗脫，分離良好且峰形尖銳、對(duì)稱。優(yōu)化后1 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液定量離子色譜圖見圖4。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)溶液SRM定量離子色譜圖Fig.4 Quantitative ion chromatography

2.4 樣品前處理方法優(yōu)化

孔雀石綠等4種藥物為陽離子型藥物，同時(shí)極性較弱，可以使用一定極性有機(jī)溶劑提取。為獲得最大的提取效率，試驗(yàn)了甲醇、乙腈、甲醇-甲酸、甲醇-氨水、乙腈-甲酸、乙腈-氨水等提取溶劑，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)酸化乙腈對(duì)4種藥物提取效果最好，進(jìn)一步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1%甲酸最佳。

2.5 方法的線性范圍與檢測(cè)限

以空白樣品提取液，配制系列標(biāo)準(zhǔn)基質(zhì)溶液（0.1、0.2、0.5、1、2 ng/mL，內(nèi)標(biāo)為 1 ng/mL）曲線進(jìn)行測(cè)試，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，各藥物線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)（R2）、線性范圍和定量限（10倍信噪比）。

表3 孔雀石綠等4種藥物的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)（R2）及定量限（LOQs，S/N=10）Table 3 Regression equation correlation coefficient（R2）and limits of quantization（LOQs，S/N=10）of four drug

2.6 方法的準(zhǔn)確度與精密度

方法的準(zhǔn)確度和精密度通過加標(biāo)回收試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。在空白魚肉樣品中按0.5、1.0、2.0 μg/kg的水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)添加，測(cè)定回收率，平行測(cè)定6份，考察方法的回收率與重現(xiàn)性，結(jié)果見表4。

2.7 實(shí)際樣品測(cè)試

應(yīng)用本方法對(duì)市售20個(gè)魚樣品進(jìn)行測(cè)定，其中1個(gè)樣品檢出隱色孔雀石綠，含量為0.68 μg/kg，同時(shí)檢出低于定量限的孔雀石綠及結(jié)晶紫；其他樣品各藥物均未檢出。實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果顯示，各藥物基線平穩(wěn)，峰形對(duì)稱，無明顯雜峰干擾，說明在線凈化效果較好。 陽性樣品SRM定量離子色譜圖見圖5。

表4 空白魚樣的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 4 Spiked recoveries and relative standard deviations（RSD）（n=6）%

圖5 陽性樣品SRM定量離子色譜圖Fig.5 Quantitative ion chromatography of postive sample

3 結(jié)論

本研究利用雙柱在線凈化、HPLC-MS/MS技術(shù)，建立了一種快速、靈敏測(cè)定魚中孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫、隱色孔雀石綠的方法。該方法4種藥物的定量限為0.5 μg/kg，達(dá)到較高靈敏度。雙柱在線凈化，實(shí)現(xiàn)了樣品凈化的自動(dòng)化，節(jié)省了檢測(cè)成本，同時(shí)凈化效率高，凈化效果好，加快了檢測(cè)速度。本方法回收率穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，適合于魚肉樣品中孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫、隱色孔雀石綠的快速測(cè)定。