， ， ，，，， ，，

空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni)是廣泛存在于家禽、家畜等動(dòng)物體內(nèi)的一種常見(jiàn)的人畜共患的食源性感染致病菌，主要引起人的急性胃腸炎，進(jìn)入血液會(huì)引發(fā)敗血癥、腦炎、心內(nèi)膜炎、心肌炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎和泌尿系統(tǒng)感染等，嚴(yán)重的還會(huì)引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病格林巴利綜合征(Guillain-Barre syndrome, GBS)[1-2]。禽類(lèi)是空腸彎曲菌最主要的傳染源，消費(fèi)禽肉及制品與該菌的流行緊密相關(guān)，故而該菌早已成為全球公共衛(wèi)生關(guān)注的重點(diǎn)[3]，因此對(duì)于空腸彎曲菌的分類(lèi)研究，以探究其致病相關(guān)性顯得尤為重要。

多位點(diǎn)序列分型(Multilocus sequence typing，MLST)技術(shù)是一種基于核酸序列測(cè)定的新型細(xì)菌分型方法，其與多位點(diǎn)酶電泳分析(Multilocus enzyme electrophoresis，MEE)原理相同，不同的是MLST通過(guò)測(cè)定細(xì)菌7個(gè)管家基因的核苷酸序列后根據(jù)序列的不同，經(jīng)比對(duì)后分別命名不同序列號(hào)管家基因的等位基因值，7個(gè)管家基因不同序列號(hào)的組合決定菌株特異的序列型(Sequence type, ST)[4-5]。MLST數(shù)據(jù)庫(kù)針對(duì)每個(gè)菌株個(gè)體都有相應(yīng)的、唯一的ST型別且每個(gè)菌屬的管家基因及引物均被標(biāo)準(zhǔn)化與統(tǒng)一，以便全球菌株MLST結(jié)果的比較分析。

依此，本研究以四川部分地區(qū)分離到的48株禽源空腸彎曲菌作為研究載體，使用MLST分子分型技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分子分型研究及遺傳進(jìn)化分析，以期進(jìn)一步從分子水平研究該菌的遺傳特性及分布特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料 48株分離株源于對(duì)四川多地區(qū)采集的禽類(lèi)盲腸及內(nèi)容物樣品的分離[6]，哥倫比亞培養(yǎng)基、Skirrow培養(yǎng)基及其對(duì)應(yīng)抗生素添加劑、腦心浸液均購(gòu)自于成都康迪生物科技有限公司，細(xì)菌基因組提取試劑盒、膠回收試劑盒均購(gòu)自于天根生化科技(北京)有限公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2分離株MLST分型方法、反應(yīng)體系及參數(shù) 參照MLST數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.mlst.net/ databases/)推薦的方法選取空腸彎曲菌 MLST分型相關(guān)的7個(gè)管家基因(aspA,glnA,glyA,gltA,tkt,pgm和uncA)作為目的基因，分別進(jìn)行擴(kuò)增與測(cè)序。

反應(yīng)體系及參數(shù)：反應(yīng)體系為25 μL：其中2×TaqPCR Mix 12.5 μL，引物(10 μmol/L)各1 μL，模板2 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL；反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、50 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，使用試劑盒回收條帶單一且明亮的擴(kuò)增片段送至華大基因測(cè)序。

1.3序列類(lèi)型(Sequence type，ST)的確定 對(duì)7個(gè)管家基因的雙向測(cè)序圖譜進(jìn)行比對(duì)，確保序列一致后將不同的基因序列在MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中提交，進(jìn)行檢索比對(duì)。根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)提供的每種等位基因的序列號(hào)，確定7個(gè)管家基因的組合，即為該菌株的ST型，并根據(jù)該菌株的ST型在數(shù)據(jù)庫(kù)中的排列序號(hào)對(duì)其命名。經(jīng)命名的ST型或出現(xiàn)新ST型，其歸因于兩種情況，存在新的等位基因序列或存在各等位基因位點(diǎn)的新組合[7]。相似的ST型菌株可組成一個(gè)ST序列群，即一個(gè)克隆系(Clonal complex，CC)[8]。

1.4遺傳進(jìn)化分析 確定所有分離株的ST型別及克隆系后，從MLST數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站(http://www.mlst.net/databases/)下載分離株及近5年國(guó)內(nèi)外多個(gè)國(guó)家不同源分離株的7個(gè)等位基因的串聯(lián)序列(按照aspA-glnA-gltA-glyA-pgm-tkt-uncA的順序排列)，采用MEGA6.0軟件中的Neighbor-jioning方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，分析本次分離株和其他地區(qū)分離株之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1分離株管家基因擴(kuò)增結(jié)果 使用空腸彎曲菌7個(gè)管家基因擴(kuò)增引物對(duì)分離株的管家基因進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，結(jié)果顯示(圖1，其中1株分離株)各管家基因的片段大小與預(yù)期結(jié)果一致。

Note: M: DNA Marker; 1：glyA；2：glnA；3：gltA；4：tkt；5：uncA；6：aspA；7：pgm圖1 空腸彎曲菌的MLST擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 MLST amplification results of Campylobacter jejuni

2.2 MLST分型結(jié)果與分析

2.2.1新序列型及新等位基因值 48株分離株中共含24種不同的序列型，其中22株分離株含有新序列型屬11個(gè)新序列型，占分離株的45.83%。新序列型中眉山鵪鶉源的8株分離株和雅安雞源的3

株分離株全為新序列型；溫江雞源的分離株中有7株屬于新序列型，占溫江雞源分離株的26.92%；溫江鴨源的分離株中有1株屬于新序列型；金堂雞源的分離株有3株屬于新序列型，占金堂分離株的33.33%。

48株分離株中共有14株分離株含有新等位基因序列，7個(gè)管家基因中的aspA,pgm,tkt,uncA基因存在新的等位基因序列，而其余3個(gè)等位基因均未發(fā)現(xiàn)新的等位基因序列。14株分離株各存在1個(gè)新等位基因序列，其中tkt位點(diǎn)共有10株分離株(V5、V6、V13-20)發(fā)現(xiàn)新等位基因序列，分離株V26、V27的pgm位點(diǎn)為新等位基因序列，aspA和uncA位點(diǎn)各有1株分離株為新等位基因序列；分離株中的V26、V27所屬的序列型有對(duì)應(yīng)的克隆系均為ST-1332CC。除此之外，另有8株分離株(C2、C4、V7、V8、V25、V33、V34、V47)存在等位基因位點(diǎn)的新組合，屬于新序列型且均無(wú)對(duì)應(yīng)的克隆系，為獨(dú)特型(表1)。

表1 空腸彎曲菌分離株中的新等位基因及新序列型
Tab.1 New allele sequences and new series of alleles ofCampylobacterjejuniisolates

StrainsaspAglnAgltAglyApgmtktuncASTClonal complexID numberV5862029228485668358670*-ID=56181V6862029228485668358670*-ID=56181V1371141221367668675*-ID=57597V1471141221367668675*-ID=57597V1571141221367668675*-ID=57597V1671141221367668675*-ID=57597V1771141221367668675*-ID=57597V1871141221367668675*-ID=57597V1971141221367668675*-ID=57597V2071141221367668675*-ID=57597V262142882225588671*ST-1332CCID=50116V272142882225588671*ST-1332CCID=50116V2886180470127255438673*-ID=50118V3744422210318676*-ID=56169C2861447047029358668*-ID=56179C486202922612729238669*-ID=56180V786202922812729238672*-ID=56183V886202922612729238669*-ID=56180V252348292264852518674*-ID=50120V333747629228682255428409*-ID=56166V347174646943358410*-ID=56167V477174646943358410*-ID=56167

Note: The bolded portion are the new allele value；* New sequence type；- No corresponding clones; ID Website：https://pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_campylobacter_isolates&page=query

2.2.248株分離株所屬不同序列型和克隆系的數(shù)量 經(jīng)序列比對(duì)后，48株分離株共含有24種不同的序列型，分屬于9種克隆系和11種獨(dú)特型。其中11種獨(dú)特型共包含21株分離株，占總分離株的43.75%。CC-21、CC-353和CC-1332均包含2種以上序列型，分別占菌株總數(shù)的12.5%、8.33%、6.25%，其余克隆系只包含一種序列型。所有的不同序列型中，獨(dú)特型ST-8675包含的菌株數(shù)最多，共包含8株分離株，占總菌株數(shù)的16.67%，ST-760、ST-464、ST-161和ST-354均包含3株以上的分離株，其余序列型只包含1-2株分離株，具體信息(表2)。

表2 48株分離株所屬不同序列型和克隆系的數(shù)量
Tab.2 Different STs and clonal complex contain 48 isolates

Clonal complexSTNumberClonal complexSTNumberCC-212982CC-692433427604Unassigned22741CC-45137184091CC-48429184102CC-52161386681CC-353586418669274521867028090286721CC-354354386731CC-464464486741CC-13326961867588671286761

2.348分離株MLST結(jié)果統(tǒng)計(jì)與分析 將分離株等位基因擴(kuò)增結(jié)果統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)48株分離株中，等位基因值的數(shù)量最多的是pgm，為14個(gè)；其次glnA，為12個(gè)；gltA、tkt、uncA、aspA均為9個(gè)；最少的glyA，為8個(gè)。等位基因值數(shù)量的多少在某種程度上反應(yīng)了該位點(diǎn)基因的多樣性，依此或可推知pgm基因最不穩(wěn)定，突變最多，而glyA基因較穩(wěn)定。依據(jù)本研究中出現(xiàn)的所有等位基因數(shù)值及其各數(shù)值所對(duì)應(yīng)菌株的數(shù)量，結(jié)果顯示，glyA基因值為2的細(xì)菌數(shù)量最多，為21株；uncA基因值為6的細(xì)菌數(shù)量次之，為17株；而出現(xiàn)的各管家基因值為1的菌株分布最為廣泛。

2.4不同克隆系、序列型包含的不同地區(qū)來(lái)源菌株的數(shù)量 將不同克隆系、序列型包含的不同地區(qū)來(lái)源的菌株的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后，結(jié)果顯示，源于(金堂養(yǎng)雞場(chǎng))的9株分離株率屬于6種序列型；源于(溫江活禽市場(chǎng)2、3)地區(qū)的分離株均有8株率屬于6種序列型；源于(眉山鵪鶉養(yǎng)殖場(chǎng))的8株分離株均歸屬于ST-8675序列型，而源于(溫江養(yǎng)雞場(chǎng)2)的分離株僅有2株率屬于2種序列型。針對(duì)克隆系而言，以CC-21包含的分離株最多為6株，以CC-45包含的分離株最少為1株。除此之外可發(fā)現(xiàn)同一個(gè)序列型包含2株及以上菌株的，菌株多為同一地區(qū)分離株，如ST-298包含2株(溫江活禽市場(chǎng)1)的分離株，ST-760包含3株(溫江養(yǎng)雞場(chǎng)1)的分離株，表明菌株的流行與地域特征有關(guān)。

2.5分離株的遺傳進(jìn)化分析 使用MEGA6.0軟件對(duì)48株分離株所含的24種序列型及國(guó)內(nèi)2株腹瀉病人空腸彎曲菌分離株、2株雞源分離株、1株鴨源分離株，以及英國(guó)、丹麥、波蘭、新西蘭、阿根廷、韓國(guó)、泰國(guó)、肯尼亞、印度雞源分離株各1株，共38株空腸彎曲菌的序列型進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建(圖2)。結(jié)果顯示，泰國(guó)和丹麥的ST-8659和ST-8661型別分離株與其余36個(gè)型別分離株處于不同分支，遺傳距離較遠(yuǎn)；眉山鵪鶉源的ST-8675型的8株分離株(V13-20)與其同屬于一大分支的其余35個(gè)型別分離株遺傳距離較遠(yuǎn)；屬于同一克隆系的2種型別菌株遺傳距離近，如同屬于CC-21克隆系的ST-298與ST-760處于同一小分支、屬于CC-1332克隆系的ST-8671與ST-696處于同一小分支；來(lái)源于同一地區(qū)不同場(chǎng)的分離株遺傳距離較近，如來(lái)源于(溫江活禽市場(chǎng)1)ST-5864序列型的V26分離株和(溫江養(yǎng)雞場(chǎng)2、活禽市場(chǎng)3)ST-8090序列型的V40、V43分離株處于同一小分支，親緣關(guān)系較近。除此之外，本研究中序列型為ST-354的V24、V42、V46分離株與英國(guó)ST-354序列型分離株處于同一小分支并與印度ST-8657序列型菌株處于同一分支，暗示著不同克隆系間的序列也存在密切相關(guān)性；國(guó)內(nèi)腹瀉病人ST-8727序列型分離株與本研究中雞源分離株C1親緣關(guān)系最近，或可推之雞與人類(lèi)感染有重要關(guān)系。

圖2 本研究24種序列型和國(guó)內(nèi)外14株分離株序列型的遺傳進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of 24 kinds of sequence types in this study and 14 sequence types in home and abroad

3 討 論

MLST作為一種常用且準(zhǔn)確的分子分型方法，具有分辨率高、可積累、重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)得到了研究者的廣泛關(guān)注[9-10]。本研究對(duì)四川部分地區(qū)分離的48株禽源空腸彎曲菌進(jìn)行MLST分型，共獲得24種不同的序列型，其中有22株分離株屬于11種新序列型，新序列型占比為45.83%，發(fā)現(xiàn)的新序列型數(shù)量所占比率與薛峰[11]、董俊[12]等從禽類(lèi)腸道分離的菌株、王新等[13]從禽肉分離的菌株以及Petra等[14]自肉雞群分離的菌株新序列型所占比率均有差異，或與不同地區(qū)分離株的遺傳進(jìn)化有關(guān)。在發(fā)現(xiàn)的新序列型中，眉山鵪鶉源的8株分離株均為新序列型且變異度較小，或與菌株間的基因水平轉(zhuǎn)移、代謝類(lèi)型相似等因素有關(guān)，是否如此機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究證實(shí)后以便為更好地揭示空腸彎曲菌致病性與分子分型之間的相關(guān)性。

空腸彎曲菌可以在多種不同宿主間進(jìn)行傳播，但某一類(lèi)宿主所攜帶的空腸彎曲菌則大多歸為某一序列型或克隆系，這可能與生態(tài)適應(yīng)、地理隔離、宿主相關(guān)等因素均有關(guān)[15]。本研究中的不同源分離株均存在獨(dú)特型序列，不同源分離株中的獨(dú)特型序列可反映出該源分離株基因間的多樣性。對(duì)分離株所含的序列型進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，鵪鶉源分離株V13-20與鴨源、雞源分離株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，表明不同家禽中的空腸彎曲菌序列型存在差異具有多樣性，分離株中出現(xiàn)新序列型或與空腸彎曲菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)量缺乏有關(guān)；分離株所含的CC-21、CC-45、CC-353、CC-354克隆系與Ragimbeau等[16]自腹瀉病人中分離到的空腸彎曲菌所含的克隆系有交叉重疊，暗示著禽類(lèi)對(duì)于人類(lèi)致病有潛在相關(guān)性。綜上所述，本研究結(jié)果為MLST數(shù)據(jù)庫(kù)的擴(kuò)充及基于該方法探究不同地域、宿主來(lái)源的空腸彎曲菌致病性與分子分型的相關(guān)性提供了參考依據(jù)。

利益沖突：無(wú)