，， ，

目前，結(jié)核病仍是世界十大死因之一。根據(jù)2016年全球結(jié)核病報(bào)告，據(jù)估計(jì)2015 年全世界新發(fā)結(jié)核病數(shù)量約為1 040萬例，其中男性590萬(占56%)，女性350萬(占 34%)，兒童100萬(占 10%)。120萬新發(fā)結(jié)核病例為艾滋病毒感染者(占 11%)，超過95%的結(jié)核病死亡發(fā)生在低收入和中等收入國家[1]。分子流行病學(xué)是研究結(jié)核病傳播的有效手段，與傳統(tǒng)的流行病學(xué)研究相比，能夠更準(zhǔn)確地預(yù)測疾病的傳播模式及其暴發(fā)流行模式，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有病例、新病例、特定傳播環(huán)境間的關(guān)系以及更易檢測出不同轄區(qū)病人間的傳播[2]。

目前，常用于結(jié)核分枝桿菌基因分型的方法有很多，主要包括間隔區(qū)寡核苷酸分型(Spacer oligonucleotide typing，Spoligotyping)、多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(Mycobacterial Interspersed Repetitive Units-Variable Number of Tandem Repeats，MIRU-VNTR)及插人序列6110(IS6110)限制性片段多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)等[3]。Kamerbeek 等設(shè)計(jì)的Spoligotyping技術(shù)，是一種獨(dú)特的PCR方法，它擴(kuò)增和標(biāo)記直接重復(fù)(Direct Repeat，DR)區(qū)域的全部DNA間隔序列，使擴(kuò)增后的 DNA與合成的寡核苷酸DNA序列探針雜交，然后根據(jù)雜交反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行基因分型。該方法快速、簡便、重復(fù)性高，適合用于臨床標(biāo)本，無須培養(yǎng)，是目前使用最頻繁的結(jié)核分枝桿菌 PCR 分型方法[4-5]。而且特別適用于IS6110 拷貝數(shù)少于5個(gè)的結(jié)核菌分離株的分子分型，適用于結(jié)核病暴發(fā)流行時(shí)確定出傳染源病例，確定實(shí)驗(yàn)室交叉污染及實(shí)驗(yàn)室或院內(nèi)感染結(jié)核分枝桿菌菌株分布及優(yōu)勢株等方面的研究[6-7]。

本研究采用Spoligotyping技術(shù)對采集的114例HIV/MTB雙重感染病例結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行基因分型研究，了解HIV/MTB雙重感染人群中結(jié)核分枝桿菌的基因型及其流行情況，對比其與單純感染MTB的結(jié)核分枝桿菌基因分型是否一致，探討其在今后HIV/MTB雙重感染病例中結(jié)核病控制中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1樣本來源 2014年至2016年，從江西省胸科醫(yī)院、南昌市第九醫(yī)院、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院及廣州市第八人民醫(yī)院和云南省傳染病?？漆t(yī)院共收集到診斷為 HIV/MTB 雙重感染114例住院患者結(jié)核菌樣本(鏡檢和培養(yǎng)均為陽性)。其中，江西省30例、廣東省48例、云南省36例。

1.2試劑及菌株 頗爾尼龍轉(zhuǎn)印膜購自上海必泰生物科技有限公司，ECL免疫印跡底物購自賽默飛公司，streptaridin-POD conjugate和CDP-star 檢測液購自德國羅氏公司，EDAC、SSPE、NaHCO3、NaOH、SDS、EDTA等購自生工生物公司、定影液和顯影液等購自銳珂醫(yī)療器材公司，43條探針引物由生工公司合成，序列見參考文獻(xiàn)[8]。結(jié)核分枝桿菌 H37RV 標(biāo)準(zhǔn)菌株來自中國疾病預(yù)防控制中心。

1.3DNA的提取 將一菌環(huán)培養(yǎng)基上生長良好的結(jié)核分枝桿菌溶于400 μL TE 緩沖液中，沸水浴10 min，12 000 r/min 離心10 min，上清即為DNA 模板，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4Spoligotyping分型 采用Kamerbeek 等推薦的Spoligotyping標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行基因分型[4]。

1.4.1帶探針膜的制備 室溫下用新鮮配制的16% EDAC在塑料容器里震蕩孵育Biodyne C膜15 min使膜活化，后用150 μL 0.5 mol/L NaHCO3稀釋寡核苷酸探針至終濃度為0.125 μmol/L，將稀釋好的探針依次加入到膜中孵育。最后用2×SSPE/0.1% SDS洗膜后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2PCR擴(kuò)增 用一對引物擴(kuò)增整個(gè)DR區(qū)。引物的序列為DRa：5′-GGTTTTGGGTCTGAC-GAC-3′，DRb：5′-CCGAGAGGGGACGGAAAC-3′。DRa引物5′端進(jìn)行生物素標(biāo)記。35 μL PCR反應(yīng)就體系：Mix 18 μL，H2O 10 μL，DRa 2 μL，DRb 2 μL，DNA 3 μL。PCR 反應(yīng)條件：96 ℃ 3 min，之后96 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸6 min。

1.4.3雜交與監(jiān)測 用150 μL 2×SSPE/0.1% SDS 稀釋PCR產(chǎn)物，100 ℃金屬浴后加到固定有探針的Biodyne C膜雜交1 h。洗膜后通過鏈霉親和素-過氧化物酶連接體streptaridin-POD conjugate孵育及CDP-star檢測液的檢測，最后用膠片曝光獲取結(jié)果。

1.4.4結(jié)果分析 將分型結(jié)果轉(zhuǎn)換后提交到數(shù)據(jù)庫平臺(tái)中進(jìn)行比對分析http://www.miru-vntrplus.org，確定菌株的基因家族。

2 結(jié) 果

2.1菌株分析 114例HIV/MTB雙重感染病例結(jié)核分枝桿菌來自3個(gè)省份(按籍貫分包括廣東、江西、云南、湖北、湖南、貴州、重慶、山東、廣西和新疆)，其中6例流調(diào)資料不詳。剩下的108例病例中，包括男性96人，女性12人；年齡在20～30之間的20人，31～40之間的42人，41～50之間的25人，51～60之間的16人，60歲以上的5人(圖1)。婚姻情況以已婚為主，占65.7%(71/108)，感染HIV和MTB順序多數(shù)為先感染HIV后感染MTB，占94.4%(102/108)。

圖1 HIV/MTB雙重感染病例年齡構(gòu)成Fig.1 Age composition of HIV/MTB co-infection patients

2.2基因分型情況 根據(jù)Spoligotyping圖譜構(gòu)建

UPGMA進(jìn)化樹，見圖2。聚類分析顯示，114例HIV/MTB雙重感染病例結(jié)核分枝桿菌成2個(gè)大的基因家族，即北京家族(Beijing Family)和非北京家族(non-Beijing Family)，分別占66.7%(76/114)和33.3%(38/114)，共30種基因型(表1)。其中，典型的北京家族基因型包含74個(gè)菌株，表現(xiàn)為僅與35-43之間的9個(gè)間隔區(qū)呈陽性雜交反應(yīng)；另有2個(gè)菌株呈北京樣基因型，表現(xiàn)為35-43之間出現(xiàn)1個(gè)位點(diǎn)的陰性反應(yīng)。此外，在HIV/MTB雙重感染病例結(jié)核分枝桿菌菌群中還存在T家族共18株(包含4種T1家族共11株、2種T2家族共2株、1種T2-T3家族1株，1種T3家族共3株和1種T4家族1株)，H家族共5株(主要為4種H3家族)，EAI5基因家族1株和CAS1_DEHLI基因家族1株。此外還存在12種基因型在數(shù)據(jù)庫中沒有對應(yīng)基因家族或沒有匹配的結(jié)果。北京家族菌株和非北京家族菌株在性別和年齡組成方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表1 114例HIV/MTB雙重感染病例結(jié)核分枝桿菌Spoligotyping分型結(jié)果
Tab.1 Spoligotyping results ofMycobacteriumtuberculosisin 114 cases of HIV/MTB co-infection patients

Spoligotyping圖譜基因家族SIT號菌株數(shù)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■■■■■■Beijing174□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■■□■■■Beijing1901□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■□■■■■Beijing2551■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■T1537■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□■□□□□■■■■■■■H3502■■■■■■■■■■■■■■■■■■□■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■T4401■■■■■■■■■■■□□■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■T110731■■■■■■■■■■■■□■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■T3373■■■■■■■■■■■■□□■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■T11311■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■□■■■T2521■■■■■■■■■■■■■■■■■■□■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■□■■■T210771■■■■■■■■■■■■□■■■■■□■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■□■■■T2-T35031■■■■■■■■■■■■■■□■■■■■■■■■■■■■■■□■□□□□■■■■■■■H3751■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□■□□□□■■■■■■■H319081■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■□■■■■■■■■■EAI52361■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□□□□□■□□□□■■■■■■■H35111■■■■■■■■■■■□■□□□□□□□□□□□■■■■■■■■□□□□■■■■■■■T12492□■■□□□□■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□□□□□□□■■■■■■■■■CAS1_DEHLI4711■■■■■■■■■■■□■■□□□□□□□□□□■■■■■■■■□□□□■■■■■■■New1■■■■■■■■■■■■■■□■■■■■■■■■■■□□□□□■□□■■■■■■■■■New1■□■■■■■■■■□□■■■■■□■■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■New2■■■□■■■□□□□■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■□■■■■■■■■■New1■■■■■■■■■■■■■■□■■■■□□■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■■■New1■■■■■■■■□□□■□□■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■New1■□■■□■■□■□□□■□□■■■■■□□■■■■■■■■□■□□■■■■■■■■■New1■□■■□□■□■■■□□■□■■■■■□■■■■■■■■■□■□□■■■■■■■■■New1■□■■■■□□■■■■□□□■□■□■□■■■■■□■■■□□□□■■■■■■■■■New1■□■■■■■□■□■□■□□■■■□■□■■■■■□■■■□■□□■■■■■■■■■New1■□■■■■■■■■■■■■□■■■■■■□□□□□□□□□□■□□□□■■■■■■■New1■■■■■■■■■■■□■□□■□■■■□■□□■□□■■■■■□□■■■■■■■■■New1

表2 114例HIV/MTB雙重感染病例結(jié)核分枝桿菌在性別和年齡構(gòu)成方面差異
Tab.2 Differences in sex and age composition ofMycobacteriumtuberculosisin 114 cases of HIV/MTB co-infection patients

人數(shù)北京家族非北京家族χ2P值性別男966630女12661.6880.194年齡20-302017331-4042251741-502517851-6016115>605235.6410.228無病例資料642

從左到右以此為：進(jìn)化樹、菌株編號、SpolDB4數(shù)據(jù)中的SIT號、基因家族、Spoligotyping圖譜圖2 HIV/MTB雙重感染病例結(jié)核分枝桿菌UPGMA進(jìn)化樹Fig.2 UPGMA-tree of the genotypes of Mycobacterium tuberculosis in HIV/MTB co-infection patients

3 討 論

本研究采用間隔寡核苷酸分型(Spoligotyping)技術(shù)對所收集的114例HIV/MTB雙重感染病例結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行了基因分型研究。結(jié)果顯示，114例結(jié)核分枝桿菌成2個(gè)大的基因家族，即北京家族(Beijing Family)和非北京家族(non-Beijing Family)，其中以北京家族菌株為主，占到66.7%。據(jù)報(bào)道，浙江(北京家族占70.0%/71.4%)[2-3]、新疆(北京家族占68.7%)、吉林(北京家族占89.5%)[7]、廣西(北京家族占55.3%)[8]、甘肅(北京家族占86.9%/87.6%)[9-10]、四川(北京家族占61.3%)[11]、北京(北京家族占85.1%)[12]、黑龍江(北京家族占89.5%)[13]、江蘇(北京家族占80.4%/81.1%)[14-15]、內(nèi)蒙古(北京家族占85.5%)[16]、上海(北京家族占80.3%)[16]、山東(北京家族占85.9%)[17]、武漢(北京家族占81.9%)[18]、西藏(北京家族占90.6%)[19]、香港(北京家族占68.5%)[20]、重慶(北京家族占75.0%/66.7%)[21-22]、江西(北京家族占75.9%)[23]等全國多省市結(jié)核分枝桿菌基因分型也是以北京家族為主。另有研究對全國部分省份的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行Spoligotyping基因分型，結(jié)果也顯示北京家族基因型為主要我國流行基因型[24-25]。本研究與單純感染MTB的流行菌株一致，均為北京家族菌株。北京家族菌株是由Van等在1995年首次報(bào)道的，它們具有特征性的spoligotyping指紋圖譜，即1-34間隔區(qū)缺失。目前，已經(jīng)在世界范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)了北京家族菌株的流行[26]。有研究指出，北京家族的產(chǎn)生可能是由于長期的卡介苗(BCG)接種和大量抗菌藥物使用的選擇性壓力造成，并且成功傳播[7-8]。另據(jù) SITVIT2 數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，全球約有1/3的結(jié)核病都是由北京家族菌株引起的，而在東亞，超過50%的結(jié)核分枝桿菌為北京家族菌株。本研究首次發(fā)現(xiàn)，在HIV/MTB雙重感染人群中，結(jié)核分枝桿菌主要流行株仍然為北京家族菌株。這在制定HIV/MTB雙重感染人群結(jié)核病的防控措施時(shí)，提示要重點(diǎn)加強(qiáng)對北京家族菌株的流行病學(xué)監(jiān)測。此外，統(tǒng)計(jì)分析顯示，在HIV/MTB雙重感染病例菌群中，北京家族菌株和非北京家族菌株在性別和年齡組成方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，因此，導(dǎo)致北京家族菌株流行的因素還有待進(jìn)一步研究。

此外，在HIV/MTB雙重感染病例結(jié)核分枝桿菌基因型中，還發(fā)現(xiàn)有T家族(15.8%，18/114)，H家族(4.4%，5/114)，EAI5基因家族和CAS1_DEHLI基因家族(分別占0.1%，1/114)。T家族和H家族菌株是非洲、歐美地區(qū)的主要流行菌株，也是本研究中發(fā)現(xiàn)的第二、三大流行菌株，分別占15.8%和4.4%，它們分別來自廣東、廣西、云南、重慶、江西和湖南等省份，這也許與近年來我國與非洲、歐美地區(qū)旅游交流頻繁有關(guān)系[27-28]。EAI5基因家族和CAS1_DEHLI基因家族主要流行于中東和印度等東南亞一些國家，近年來在中國新疆等省份也有發(fā)現(xiàn)[29-31]。本研究發(fā)現(xiàn)的該家族菌株均來自廣東。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)12種在數(shù)據(jù)庫中沒有對應(yīng)基因家族或沒有匹配的結(jié)果的菌株，提示在HIV/MTB雙重感染病例結(jié)核分枝桿菌菌群中，可能存在新的突變基因型，但其具體分型和流行病學(xué)意義有待進(jìn)一步研究。

本研究首次對HIV/MTB雙重感染病例結(jié)核分枝桿菌基因型進(jìn)行了初步的研究，發(fā)現(xiàn)北京家族菌株為HIV/MTB雙重感染病例結(jié)核分枝桿菌菌群的主要流行菌株。同時(shí)還存在T家族、H家族、EAI5家族和CAS1_DEHLI家族菌株等其他家族的結(jié)核分枝桿菌。這對HIV/MTB雙重感染人群結(jié)核病的流行趨勢分析、防控措施制定等具有重要指導(dǎo)意義。

利益沖突：無