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結核病是由結核分枝桿菌 (Mycobacteriumtuberculosis, MTB) 引起的一種傳染性強的慢性傳染病，尤其在人口密集地方以及其他傳染疾病如艾滋病等并發(fā)感染已經(jīng)呈上升的趨勢[1]。結核分枝桿菌作為一類人獸共患病病原體能夠感染多種宿主，并經(jīng)多種途徑和方式傳播，在人體多個器官都能形成感染病灶，引發(fā)肺結核、腎結核、皮膚結核等，而且感染早期診斷往往由于病癥表現(xiàn)不明顯而造成誤診[2-4]。對結核病的快速診斷和合理治療是有效控制結核傳染的關鍵[5]，目前結核病的臨床檢測大都具有明顯的缺點，如耗時長、特異性差和敏感性低等。利用特異性抗原的結核病血清學快速診斷具有特異性高和敏感性強的特點，有望成為結核病臨床診斷首選方法，而從結核菌基因組蛋白中尋找敏感性和特異性強的抗原蛋白則是進行血清學診斷的基礎。Rv3425、Rv1168c蛋白均屬于PPE蛋白家族，特點是富含甘氨酸且為結核分枝桿菌所特有，其N端附近序列為Pro-Pro-Glu結構域。Rv3425屬結核菌RDII區(qū)，僅僅存在于致病性分枝桿菌中，該蛋白為免疫顯性的B細胞目標抗原，能夠用于鑒別肺結核和肺外結核，在臨床檢測等應用上具有一定價值[6-7]。Rv1168c蛋白具有很強的保守性，亦屬于結核分枝桿菌特有。Rv1168c蛋白在結核分枝桿菌攜帶者體內(nèi)能激發(fā)特異的細胞免疫反應，對感染者具有免疫保護性[8-9]。本研究參照以往的工作基礎，通過以結核分枝桿菌H37Rv的基因組為模板，采用重疊PCR方法擴增Rv3425-Rv1168c核酸序列并進行原核表達與純化，并且通過血清學評價重組蛋白進行臨床診斷的可行性，為研制更為有效的結核病免疫診斷試劑以及新型疫苗和新型藥物研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1材料 原核表達質(zhì)粒pET-24b、結核分枝桿菌H37Rv基因組、表達菌種BL21(DE3)均由本實驗室保存；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購于OMEGA(美國)；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、TaqDNA聚合酶和dNTP均購于NEB公司；臨床確診結核患者血清由結核病研究所臨床檢驗室提供；非結核呼吸疾病患者血清來自本院呼吸科住院病人；健康人血清來自本院體檢中心；引物合成與測序均由北京華大基因公司完成；酶標羊抗人IgG(HRP)購自索萊寶生物工程技術公司；親和色譜填料購自GE公司；其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1引物設計 根據(jù)結核分枝桿菌Rv3425、Rv1168c基因序列，設計合成了重疊PCR特異性引物，在Rv3425 N端引物5′ 端引入限制性內(nèi)切酶NdeⅠ位點，在Rv1168c C端引物3′端引入限制性內(nèi)切酶XhoⅠ酶切位點。終止密碼子為原核偏好密碼子TAA。引物設計如下：

P1: 5′-GGATCCCATATGCATCCAATGATACCAGCGGAG-3′；

P2: 5′-CTACAGGGGCGGGGGTGGAGGTGGA-AGTGCGAACGCCTGGAAG -3′；

P3: 5′-CTTCCAGGCGTTCGCACTTCCACCTCCACCCCCGCCCCTGTAG -3′；

P4: 5′-TATGGAGCTCTTACCGCAGTATCAC-TCCG-3′

1.2.2Rv3425-Rv1168c重組質(zhì)粒的構建與表達 以結核分枝桿菌H37Rv基因組為模板，分別用引物P1與P3，P2與P4擴增Rv3425與Rv1168c核酸序列，將擴增所得的兩段PCR產(chǎn)物混合，1∶100進行稀釋后作為模板，用引物P1與P4進行擴增獲得Rv3425-Rv1168c全核酸序列。重疊PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒載體pET-24b均以NdeⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，然后在T4DNA連接酶的作用下，將Rv3425-Rv1168c表達序列克隆到表達質(zhì)粒pET-24b中，篩選測序正確的質(zhì)粒進行保存。取重組工程菌活化后接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃條件下震蕩培養(yǎng)，在菌液OD600達到約0.4后，加入IPTG至終濃度為0.4 mmol/L，在37 ℃，200 r/min條件下繼續(xù)震蕩誘導表達7 h。離心收集菌體，低溫條件下進行超聲破碎，12%SDS-PAGE分析目的蛋白Rv3425-Rv1168c的表達水平和存在形式。

1.2.3Rv3425-Rv1168c蛋白復性、純化 Rv3425-Rv1168c蛋白主要以包涵體的表達形式存在。將包涵體用1%的Triton-X 100洗滌兩次，包涵體用8 mol/L尿素和PBS緩沖液充分變性溶解，高速離心收集上清。上清液進行柱上復性，4 ℃條件下取上清過鎳離子親和柱，以PBS緩沖液緩慢洗滌，然后分別以50 mmol/L、150 mmol/L咪唑洗脫雜蛋白和目的融合蛋白，SDS-PAGE分析目的蛋白的純度。對純化目的融合蛋白進行水透析后以冰干保存。

1.2.4Rv3425-Rv1168c蛋白免疫印跡與ELISA分析 純化Rv3425-Rv1168c蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后通過半干法轉到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，洗滌后以3例強陽性人血清和6例健康人血清分別震蕩孵育30 min，HRP標記的羊抗人IgG孵育1 h后，震蕩洗滌5次，ECL暗室自動曝光顯影分析Rv3425-Rv1168c蛋白的抗原特異性。

以0.05 mmol/L碳酸鈉將Rv3425-Rv1168c重組蛋白稀釋至3 μg/mL，包被過夜后，37 ℃封閉2 h，PBST洗板4次；3%BSA于4 ℃封閉過夜，洗板5次，分別用臨床確診的100份臨床確診結核患者血清、20例非結核呼吸疾病患者血清和100份健康人血清(血清稀釋度為1∶50)37 ℃孵育1 h，重新洗板若干次，每孔中加入用PBS稀釋成1∶1 000的HRP標記的羊抗人IgG 100 μL，于37 ℃溫箱放置1 h，洗板5次，加TMB顯色液置于37 ℃溫箱中反應30 min顯色，終止反應。酶標儀檢測D450nm波長處的A值，陽性結果判定以cut-off值為健康人血清檢測平均A值+3倍標準差。

2 結 果

2.1Rv3425-Rv1168c融合表達載體的構建 通過PCR方法獲得的Rv3425與Rv1168c核酸序列后再采用重疊PCR的方法獲得Rv3425-Rv1168c核酸全序列，取少量PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結果如圖1所示，在目的分子量530 bp、970 bp、1 518 bp處分別有清晰的Rv3425、Rv1168c以及Rv3425-Rv1168c條帶。雙酶切重疊PCR產(chǎn)物，克隆到載體pET-24b 中，轉化至感受態(tài) BL(DE3) 細胞。

M. DL2000；1. Rv3425核酸片段；2. Rv1168c核酸片段；3. Rv3425-Rv1168c核酸片段圖1 Rv3425-Rv1168c核酸序列PCR凝膠電泳鑒定結果Fig.1 Gel electrophoresis identification results of PCR products of Rv3425-Rv1168c nucleic acid fragment

2.2Rv3425-Rv1168c融合蛋白原核表達分析 將工程菌接種含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，經(jīng)IPTG誘導后，低溫條件下對菌體超聲破碎，SDS-PAGE電泳結果顯示(圖2)，在目的分子量55 kD處，Rv3425-Rv1168c獲得較高表達，但主要以包涵體的形式存在，融合蛋白的表達量占細菌總蛋白的30%左右。

M.低分子量蛋白標準；1.未誘導的全菌體蛋白；2.經(jīng)IPTG誘導的全菌體蛋白；3.超聲上清；4.超聲沉淀圖2 pET-24b-Rv3425-Rv1168c原核表達產(chǎn)物SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of prokaryotic expression products of pET-24b-Rv3425-Rv1168c

2.3Rv3425-Rv1168c融合蛋白包涵體復性與純化 Rv3425-Rv1168c包涵體經(jīng)過初步提純，在8 mol/L尿素與PBS緩沖液的變性條件下進行親和純化，分別以50 mmol/L、150 mmol/L咪唑洗脫雜蛋白和目的融合蛋白，通過SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)(如圖3所示)，純化后的融合蛋白純度可達到90%以上，對純化的蛋白按1∶1的比例水透析6次后冰干保存。

M.低分子量蛋白標準；1.上樣前；2. 50 mmol/L咪唑洗脫峰；3. 150 mmol/L咪唑洗脫峰圖3 Rv3425-Rv1168c融合蛋白親和純化SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of the affinity purification products of Rv3425-Rv1168c fusion protein

2.4Rv3425-Rv1168c融合蛋白Western Blot與ELISA分析 純化后的Rv3425-Rv1168c融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉移至PVDF膜上，分批次經(jīng)3例強陽性人血清和6例健康人血清孵育、HRP標記羊抗人二抗結合反應，Western Blot結果見圖4。結果表明，純化后的Rv3425-Rv1168c融合蛋白能與3例確診結核病人血清抗體結合，而與健康人對照血清標本不反應，顯示重組融合蛋白具有較強的抗原性和特異性。

圖4 Rv3425-Rv1168c與不同人陽性血清Western Blot結果Fig.4 Western blot results of the reactions of Rv3425-Rv1168cfusion protein with 3 TB patient sera

分別以100份臨床確診結核患者血清、20例非結核呼吸疾病患者血清和100份健康人血清與Rv3425-Rv1168c融合蛋白進行ELISA檢測實驗，結果如圖5所示，其中設定cut-off值為健康人血清檢測平均A值+3倍標準差。

圖5 重組Rv3425-Rv1168c蛋白與不同人血清ELISA結果Fig.5 ELISA results of the reactions of Rv3425-Rv1168c fusion protein with sera of TB patients, non-tuberculous patients and healthy people

統(tǒng)計實驗結果為臨床確診結核患者血清陽性檢出例數(shù)為54例，檢出陽性率為54%；非結核呼吸疾病患者血清檢出1例，檢出率為5%；健康人血清檢出2例，檢出率為2%，特異度為95%。ELISA結果說明，獲得的重組融合蛋白Rv3425-Rv1168c在進行結核病血清學檢測上具有可觀的敏感性和特異性，可用于結核病人的血清學診斷。

3 討 論

造成結核病誤診率和漏診率高的一個很重要的原因就是對結核分枝桿菌的感染缺乏快捷、靈敏的檢測方法。目前，臨床上主要采用的結核病檢測方法包括抗酸染色、結核菌培養(yǎng)、血清學檢測、芯片檢測等[10-13]。其中，血清學診斷由于具有操作簡單、穩(wěn)定性強等特點，是診斷結核病的主要研究方向之一。然而，由于血清學診斷對于檢測抗原的免疫原性和特異性都有較高的要求，因而在實際操作中也存在一定的局限性，例如敏感度較低、特異性差等。因此研究者一直在尋找結核分枝桿菌特異性強的抗原去用于結核病的血清學診斷的研究。PPE蛋白家族占有結核分枝桿菌全基因10%的開放閱讀框(ORFs)，它們在序列和結構上的特異性在開發(fā)新型特異性診斷抗原或者結核疫苗的方面可能具有一定優(yōu)勢[14]。結核分枝桿菌Rv3425、Rv1168c蛋白都是PPE家族成員，它們除了共有PPE結構域外，沒有其它的共同作用位點，因此不會產(chǎn)生抗原抗體的交叉反應，而且表現(xiàn)出較強的免疫活性，能將結核病患者與BCG接種者區(qū)別開[15]。

目前針對結核病的實驗室診斷中，還沒有一種特異抗原能夠在結核患者血清學檢測中獲得令人滿意的結果，本實驗室前期工作分別將Rv3425蛋白與Rv1168c蛋白進行表達和純化，在進行大量臨床樣本進行血清學驗證時，敏感度分別為45%和51%，特異性均可達到97%以上，雖然在臨床血清學驗證中取得了較好結果，但敏感性還達不到臨床實驗室檢測的要求[16-17]。通過多個特異抗原的融合串聯(lián)重組可以提高抗原的敏感性，在本實驗中我們將Rv3425蛋白與Rv1168c蛋白進行融合表達和純化，并采用western-blot和ELISA實驗來驗證融合蛋白的特異性和敏感性。從實驗結果看，純化后的Rv3425-Rv1168c融合蛋白血清學敏感度能夠達到54%，特異度為95%，相對單個Rv3425蛋白或者Rv1168c蛋白，敏感性存在一定程度提高。但融合抗原與非結核呼吸疾病患者血清也存在部分交叉反應，其原因可能是融合抗原序列中含有較多的非保守序列，降低了特異性，因此該融合抗原的敏感性和特異性仍后期需擴大樣本量進行重復驗證。本次實驗獲得的融合抗原相對其它結核菌抗原具有較為明顯的優(yōu)勢，這與我們預期的實驗結果基本吻合。此次實驗結果提示Rv3425-Rv1168c融合蛋白能夠作為結核病診斷的潛在檢測抗原，該結果為后期的結核病免疫診斷試劑的研制和開發(fā)打下基礎。

利益沖突：無