成福 張秋寒 唐曉蓮 王萬(wàn)能

(1.重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054；2.重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院中國(guó)藥房編輯出版中心，重慶 400042)

淺部真菌感染(superficial fungal infections，SFIS)是親角質(zhì)層的真菌感染引起的皮膚癬病，常見(jiàn)有體癬、足癬、股癬、甲癬、頭癬和面癬等，影響了20%～25%的人口[1-3]。皮膚癬菌是一類絲狀真菌，其作為SFIS的主要病原體可侵襲感染角質(zhì)豐富的皮膚、毛發(fā)和指甲等部位，從而導(dǎo)致皮膚癬病的發(fā)生[4]。研究發(fā)現(xiàn)，引起皮膚癬病的菌屬主要有毛癬菌屬、表皮癬菌屬、犬小孢子菌屬三類[5]，且約60%的皮膚癬病是由紅色毛癬菌感染所致，嚴(yán)重危害人類健康[6]。此外，由于近年來(lái)廣譜抗生素、皮質(zhì)類固醇以及免疫抑制劑的廣泛使用，臨床上的真菌感染率也逐年上升[7-8]。在真菌性侵染引起的皮膚癬病中，烯丙胺類和唑類藥品是用于治療真菌感染的常用藥物，但因它們存在不同程度的毒副作用，且由于真菌感染具有高復(fù)發(fā)性特點(diǎn)，導(dǎo)致當(dāng)前使用的藥物治療效果降低，難以治愈[9]。此外，目前新的抗真菌藥物的開(kāi)發(fā)幾近處于停滯狀態(tài)，而真菌耐藥性問(wèn)題卻日漸嚴(yán)重，故開(kāi)發(fā)新型抗真菌藥物具有重要意義。芳樟醇是一種不飽和萜烯類物質(zhì)，廣泛存在于天然植物中，具有抗焦慮、抗炎、抗驚厥、抗菌等多種生物活性作用，已被應(yīng)用于化妝品及食品工業(yè)[10]。有研究報(bào)道芳樟醇對(duì)口腔齲齒等細(xì)菌具有抑制作用[11]，并能抑制葡萄球菌、大腸埃希氏菌、變形桿菌、腸炎桿菌、酵母菌、黑曲霉等菌株[12]，具有抑制皮膚癬菌的巨大潛力。本文以芳樟醇為研究對(duì)象，探究其對(duì)紅色毛癬菌的抗菌作用機(jī)理，為開(kāi)發(fā)新型抗真菌藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芳樟醇(上海麥克林生化科技有限公司，純度>97%)；二甲基亞砜(成都市科龍化工試劑廠)；鹽酸特比萘芬(大連美侖生物技術(shù)公司)；地塞米松注射液(湖北天藥藥業(yè)有限公司)；特比萘芬凝膠(浙江得恩德制藥有限公司)；實(shí)驗(yàn)用紅色毛癬菌為重慶市陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院皮膚科臨床分離菌株。

生化培養(yǎng)箱(山東智誠(chéng)儀器制造有限公司)；立式高溫壓力滅菌器(制微儀器有限公司)；雙目生物顯微鏡(上海光學(xué)儀器廠)；低溫冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；Hitachi-7500透射電鏡(日本日立公司)。

豚鼠(260±20 g)，雌雄各半，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，于恒溫(24～26℃)、恒濕(45% ～ 65%)條件下進(jìn)行12 h明暗交替喂養(yǎng)，自由進(jìn)食及飲水。

沙堡弱葡萄糖瓊脂(SDA)培養(yǎng)基：葡萄糖4 g，蛋白胨1 g，瓊脂1.8 g，蒸餾水100 mL,pH 7.0，沙堡弱葡萄糖液體培養(yǎng)基(SDB)則不加瓊脂。

1.2 方法

芳樟醇抗紅色毛癬菌的最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定 將2.56 mg芳樟醇溶于少量二甲基亞砜(DMSO)后加入SDB制備濃度為2.56 mg·mL-1母液，備用。調(diào)整紅色毛癬菌濃度為1×105CFU/mL。參考Pereira等[13]改良CLSI M38-A2法，吸取100 μL SDB溶液加入96孔板，然后加入芳樟醇溶液連續(xù)2倍稀釋至0.0625 μg·mL-1，使芳樟醇濃度為128 0～0.0625 μg·mL-1。以等量SDB溶液作為對(duì)照，最后每孔加入10 μL紅色毛癬菌孢子懸液于28℃培養(yǎng)5 d，NCCLS方案建議將完全不生長(zhǎng)紅色毛癬菌的濃度判定為芳樟醇抑制紅色毛癬菌的最小抑菌濃度。

芳樟醇對(duì)紅色毛癬菌孢子萌發(fā)的影響 調(diào)整孢子懸液的濃度為1×106CFU/mL，取0.5 mL孢子懸液與0.5 mL的芳樟醇(終濃度設(shè)置為0、1/2MIC、MIC、2MIC)混勻后于28℃孵育24 h，通過(guò)顯微鏡觀察紅色毛癬菌的孢子萌發(fā)情況，以芽管長(zhǎng)度超過(guò)孢子直徑長(zhǎng)度的一半判定為孢子萌發(fā)，計(jì)算孢子萌發(fā)率(萌發(fā)率=孢子萌發(fā)數(shù)/孢子總數(shù)×100%)[14]。

芳樟醇對(duì)紅色毛癬菌菌絲徑向生長(zhǎng)及菌絲形態(tài)的影響 紅色毛癬菌于SDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)14 d后，用直徑12 mm的打孔器取平板中生長(zhǎng)均勻的菌塊，備用。定量配置含芳樟醇終濃度為2 MIC、MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC的SDA固體培養(yǎng)基，用打孔器打孔后將菌塊接種至打孔處，28℃孵育7 d，并測(cè)量各組菌絲生長(zhǎng)直徑，每個(gè)處理重復(fù)3個(gè)平板。

菌絲徑向生長(zhǎng)抑制率(%)=(對(duì)照組菌落直徑-實(shí)驗(yàn)組菌落直徑)/對(duì)照組菌落直徑×100%[14]。

芳樟醇濃度設(shè)置及處理同上，將不同濃度的芳樟醇與紅色毛癬菌共孵育4 d后，經(jīng)乳酸棉蘭染色后于顯微鏡下觀察其菌絲生長(zhǎng)情況。

芳樟醇對(duì)紅色毛癬菌細(xì)胞膜通透性的影響 調(diào)整紅色毛癬菌孢子濃度為1×106CFU/mL，按1%將菌懸液接種于SDB培養(yǎng)基， 28℃ 120 r/min培養(yǎng)7 d后，菌絲體用無(wú)菌濾紙收集，水洗3次。取2 g紅色毛癬菌菌絲體，加入20 mL不同濃度的芳樟醇溶液使其終濃度為2 MIC、MIC、1/2 MIC，以無(wú)菌水為對(duì)照，每組設(shè)置3組平行，于0、1、2、3、4、5 h后測(cè)定電導(dǎo)率[15]。

芳樟醇對(duì)細(xì)胞膜麥角甾醇合成的影響 取1 g菌絲，加入10 mL 25%氫氧化鉀乙醇溶液，渦旋儀斡旋5 min后置于85℃水浴2 h。加入水∶正庚烷(1∶3)，渦旋5 min，取正庚烷層液體于-20 ℃過(guò)夜。麥角甾醇于281.5 nm下有吸收，去氫麥角固醇在230 nm下有吸收，計(jì)算麥角甾醇的含量：

麥角甾醇%+去氫麥角甾醇= [(A281.5/290)×F]/濕菌重；去氫麥角甾醇=[(A230/518)×F]/濕菌重；

麥角甾醇% =[麥角甾醇%+去氫麥角甾醇]-去氫麥角甾醇；F：稀釋倍數(shù)；290和518為常數(shù)[16]。

芳樟醇對(duì)紅色毛癬菌超微結(jié)構(gòu)的影響 將3 mL孢子懸液與3 mL芳樟醇加入無(wú)菌試管中使終濃度為2 MIC、MIC、1/2MIC，對(duì)照添加SDB溶液，置于28℃培養(yǎng)7 d后以4 000 r/min離心10 min去上清液，將沉淀重懸于1.5 mL EP管中，再10 000 r/min離心15 min去上清液，沉淀加入戊二醛4℃固定4 h。固定完成后用0.1 mol/L PBS清洗3次，然后用無(wú)菌雙蒸水清洗3次，再脫水、滲透、包埋聚合、切片、染色后，透射電鏡觀察，Gatan-780CCD拍照記錄[17]。

構(gòu)建紅色毛癬菌感染豚鼠模型及芳樟醇藥效評(píng)價(jià) 參考文獻(xiàn)報(bào)道的方法[18]，以卡波姆為基質(zhì)制備芳樟醇凝膠劑，其包含0.8 g卡波姆、5 g甘油、0.4 g丙二醇、0.032 g芳樟醇、1.08 g的三乙醇胺，加水至100 g。將40只雌雄各半的豚鼠均分為空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組及芳樟醇組。在豚鼠背部進(jìn)行2.5 cm×2.5 cm脫毛，粗砂紙磨傷豚鼠脫毛處皮膚并接種紅色毛癬菌。除空白組外，其余組均接種紅色毛癬菌，并連續(xù)4 d腹腔注射地塞米松(7.5 mg/kg)。4 d后取樣皮損處皮屑，用10%的KOH處理后鏡檢并取皮屑接種至SDA平板判定模型是否構(gòu)建成功[19]。建模成功后，陽(yáng)性組施用特比萘芬凝膠，實(shí)驗(yàn)組施用芳樟醇凝膠，空白組和模型組則施用不含藥凝膠，每日用藥2次。治療結(jié)束后，處死豚鼠，取背部皮膚用4%多聚甲醛溶液中固定48 h后，乙醇梯度脫水，二甲苯處理，石蠟包埋后進(jìn)行切片，常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色后鏡檢。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析(one-way ANOVA) ，組間采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，P<0. 05認(rèn)定為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 芳樟醇抗紅色毛癬菌的最小抑菌濃度

芳樟醇與紅色毛癬菌于28℃共孵育5 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照和含2.5、5、10、20、40、80、160 μg·mL-1芳樟醇溶液的孔中變渾濁，表明有紅色毛癬菌的生長(zhǎng)，但濃度為80 μg·mL-1和160 μg·mL-1的芳樟醇溶液處理后的紅色毛癬菌數(shù)量明顯減少，表明隨著芳樟醇濃度的升高芳樟醇對(duì)于紅色毛癬菌的抑制作用逐漸增強(qiáng)。此外，當(dāng)芳樟醇藥液在320 μg·mL-1濃度時(shí)，顯示無(wú)紅色毛癬菌生長(zhǎng)，因此實(shí)驗(yàn)判定芳樟醇抑制紅色毛癬菌的最小抑菌濃度為320 μg·mL-1。

2.2 芳樟醇對(duì)紅色毛癬菌孢子的萌發(fā)的影響

孢子作為真菌繁殖的重要器官之一，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)芳樟醇呈劑量依賴性方式抑制紅色毛癬菌的孢子萌發(fā)。當(dāng)160 μg·mL-1的芳樟醇濃度處理后，紅色毛癬菌孢子的萌發(fā)率為42.25%(P<0.0001)；芳樟醇濃度為320 μg·mL-1時(shí)，其孢子的萌發(fā)率為37.12%(P<0.0001)；而當(dāng)芳樟醇濃度為640 μg·mL-1時(shí)，其萌發(fā)率僅為12.09%(P<0.0001)，表明芳樟醇能有效抑制紅色毛癬菌孢子的萌發(fā)。見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度芳樟醇對(duì)紅色毛癬菌孢子萌發(fā)率的影響 (****：P<0.0001,相比于對(duì)照) 圖2 芳樟醇對(duì)紅色毛癬菌菌絲的作用. A.不同濃度芳樟醇對(duì)紅色毛癬菌菌絲徑向生長(zhǎng)抑制率；B.芳樟醇作用后紅色毛癬菌菌絲形態(tài)變化結(jié)果(a.對(duì)照組；b.芳樟醇640 μg·mL-1；c.芳樟醇320 μg·mL-1；d.芳樟醇160 μg·mL-1；×400) 圖3 芳樟醇對(duì)紅色毛癬菌電導(dǎo)率的影響 圖4 芳樟醇對(duì)紅色毛癬菌麥角甾醇合成的影響(**：P<0.01,相比于對(duì)照) 圖5 芳樟醇對(duì)紅色毛癬菌孢子及菌絲的影響. A.未經(jīng)芳樟醇處理的菌絲；B.芳樟醇處理后的菌絲；C.未經(jīng)芳樟醇處理的孢子；D.經(jīng)芳樟醇(160 μg·mL-1)處理后的孢子；E.芳樟醇(320 μg·mL-1)處理后的孢子；F.經(jīng)芳樟醇(640 μg·mL-1)處理后的孢子Fig.1 The effect of different concentrations of linalool on the spore germination rate of Trichophyton rubrum(****：P<0.0001, Compared to control) Fig.2 The effect of linalool on the hyphae of Trichophyton rubrum A.The inhibition rate of different concentrations of linalool on the radial growth of Trichophyton rubrum hyphae; B.The morphological changes of Trichophyton rubrum hyphae after linalool (a. Control group; b. Linalool 640 μg·mL-1; c. Linalool 320 μg·mL-1; d. Linalool 160 μg·mL-1; ×400) Fig.3 The effect of linalool on the conductivity of Trichophyton rubrum Fig.4 The effect of linalool on the synthesis of ergosterol by Trichophyton rubrum (**：P<0.01, compared to control) Fig.5 The effect of linalool on the spores and hyphae of Trichophyton rubrum. A. Hypha without linalool treatment; B. Hypha after linalool treatment; C. Spores without linalool treatment; D. After linalool treatment (160 μg·mL-1); E. Spores treated with linalool (320 μg·mL-1); F. Spores treated with linalool (640 μg·mL-1)

2.3 芳樟醇對(duì)紅色毛癬菌菌絲的影響

圖2A顯示芳樟醇對(duì)紅色毛癬菌的菌絲徑向生長(zhǎng)作用，較對(duì)照組相比，40 μg·mL-1的芳樟醇濃度處理后其抑制率為10.56%。當(dāng)芳樟醇濃度為320 μg·mL-1時(shí)，菌絲生長(zhǎng)抑制率已高達(dá)88.27%。當(dāng)芳樟醇濃度為 640 μg·mL-1時(shí)，幾乎完全抑制菌絲的生長(zhǎng)，結(jié)果表明芳樟醇呈劑量依賴性抑制紅色毛癬菌菌絲的徑向生長(zhǎng)，隨著芳樟醇濃度的升高，其菌絲的徑向生長(zhǎng)直徑隨之減小。此外，如圖2B(a)，與對(duì)照組相比，經(jīng)不同濃度芳樟醇處理后，紅色毛癬菌的菌絲出現(xiàn)萎縮，表面變得粗糙，局部壞死，細(xì)胞質(zhì)發(fā)生自溶，菌絲的多處出現(xiàn)斷裂等現(xiàn)象，且隨著芳樟醇濃度的增大破壞作用越明顯，芳樟醇顯示出對(duì)紅色毛癬菌菌絲強(qiáng)烈的破壞作用，見(jiàn)圖2B(b-d)。

2.4 芳樟醇對(duì)紅色毛癬菌細(xì)胞膜通透性的影響

如圖3所示，對(duì)照組的電導(dǎo)率增長(zhǎng)緩慢，在2 h后已趨于平穩(wěn)，電導(dǎo)率較其他組低。與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組的電導(dǎo)率隨時(shí)間的增加而升高，且在1 h后電導(dǎo)率出現(xiàn)顯著上升，說(shuō)明體系中離子含量增多，可能是細(xì)胞膜被破壞，導(dǎo)致內(nèi)容物流出。而后電導(dǎo)率上升幅度逐漸下降，4 h后的電導(dǎo)率已趨于平緩，此時(shí)體系中可能已經(jīng)處于一個(gè)平衡的狀態(tài)，離子不再大量滲漏，結(jié)果表明芳樟醇作用紅色毛癬菌以劑量依賴性的方式引起電導(dǎo)率的升高，從而破壞紅色毛癬菌細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致紅色毛癬菌細(xì)胞內(nèi)容物泄露，細(xì)胞內(nèi)離子失衡，達(dá)到抑菌效果。

2.5 芳樟醇抑制紅色毛癬菌細(xì)胞膜麥角甾醇合成

實(shí)驗(yàn)探究了芳樟醇對(duì)紅色毛癬菌與細(xì)胞膜麥角甾醇含量的影響，未經(jīng)過(guò)處理的紅色毛癬菌麥角甾醇含量為0.0063%，與對(duì)照組相比，160 μg · mL-1芳樟醇濃度處理后其麥角甾醇含量降低了28.6%。320 μg · mL-1芳樟醇濃度處理后，麥角甾醇含量降低了39.7%(見(jiàn)圖4)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明隨著芳樟醇濃度的增加，紅色毛癬菌細(xì)胞膜中的麥角甾醇含量減少，芳樟醇能抑制其細(xì)胞膜麥角甾醇的合成。

2.6 芳樟醇對(duì)紅色毛癬菌超微結(jié)構(gòu)的影響

通過(guò)透射電鏡觀察芳樟醇作用紅色毛癬菌后的超微結(jié)構(gòu)結(jié)果如圖5。未經(jīng)芳樟醇處理的紅色毛癬菌的菌絲和孢子超微結(jié)構(gòu)如圖5A、C，紅色毛癬菌的細(xì)胞壁完整，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)有細(xì)胞損傷。而經(jīng)不同濃度的芳樟醇處理后的孢子如圖5D、E、F，結(jié)果顯示其細(xì)胞壁部分被降解，細(xì)胞的表面粗糙且厚薄不勻。此外，其細(xì)胞膜也顯示皺縮破損、凹陷、輪廓模糊的現(xiàn)象，并伴有膜碎片的產(chǎn)生以及胞內(nèi)物質(zhì)泄露等。進(jìn)一步的，細(xì)胞核也顯示出輕度凝集和破碎，且隨著藥液作用濃度的增加，芳樟醇對(duì)紅色毛癬菌超微結(jié)構(gòu)的破壞作用增加。

2.7 芳樟醇治療紅色毛癬菌感染豚鼠模型的藥效評(píng)價(jià)

如圖6A、B所示，脫毛后豚鼠皮膚平整無(wú)傷痕，而磨皮后有滲血。圖6C(c)顯示豚鼠感染紅色毛癬菌7 d后出現(xiàn)暗紅色結(jié)痂，角質(zhì)硬化，伴有大量皮屑產(chǎn)生，并取紅色毛癬菌感染豚鼠背部皮屑經(jīng)顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)紅色毛癬菌菌絲，鏡檢結(jié)果為陽(yáng)性，見(jiàn)圖6D(d)。同時(shí)經(jīng)過(guò)菌落培養(yǎng)顯示明顯的紅色毛癬菌特征性菌落，見(jiàn)圖6E(e)，表明豚鼠模型構(gòu)建成功。

圖6 紅色毛癬菌感染豚鼠模型的建立圖 圖7 豚鼠皮膚表觀變化 圖8 豚鼠皮屑培養(yǎng)結(jié)果。A(a).芳樟醇用藥5 d后的皮屑培養(yǎng)圖，A為正面，a為背面；B(b).特比萘芬用藥5 d后皮屑培養(yǎng)圖，B為正面，b為背面；C(c).模型對(duì)照組未用藥12 d皮屑培養(yǎng)圖，C為正面，c為背面；D.芳樟醇用藥第10天皮屑培養(yǎng)圖；E.特比萘芬用藥第12天皮屑培養(yǎng)圖Fig.6 The establishment of the guinea pig model ofTrichophyton rubrum infection Fig.7 The apparent changes of guinea pig skin Fig.8 Results of guinea pig dander culture. A(a). Dander culture after linalool administration for 5 days, A is front, a is back; B(b). Dander culture after terbinafine administration for 5 days, B is front, b is back; C(c). Model control The dandruff culture picture of the group without medication for 12 days, C is the front, c is the back; D. The dandruff culture picture of the linalool medication on the 10th day; E. The dandruff culture picture of the terbinafine medication on the 12th day

經(jīng)芳樟醇及特比萘芬凝膠給藥5 d后分別見(jiàn)圖7A(a)、C(c)，結(jié)果顯示其皮屑較用藥前明顯減少，結(jié)痂脫落，損傷的皮膚得到恢復(fù)。另外，實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性組用藥5 d后刮取皮屑經(jīng)平板培養(yǎng)10 d后如圖8A(a)和圖8B(b)，結(jié)果觀察到有菌落生長(zhǎng)，菌落正面中心皺褶狀顆粒隆起，并有紅色色素生成，為明顯的紅色毛癬菌菌落特征。芳樟醇治療10 d后如圖7B(b)，皮屑消失，毛發(fā)正常生長(zhǎng)，與陽(yáng)性組處理12 d后狀態(tài)無(wú)明顯差別，見(jiàn)圖7D(d)，且兩組平板菌落鑒定顯示無(wú)紅色毛癬菌生長(zhǎng)圖8D和圖8E。值得注意的是，模型組中的豚鼠感染12 d后如圖7E(e)，仍存在大量的皮屑，并且傷口處皮屑堆積成塊狀，未脫落，將感染處皮屑接種于SDA平板生長(zhǎng)出明顯的紅色毛癬菌特征菌落，見(jiàn)圖8C(c)。此外，圖7F(f)顯示紅色毛癬菌感染17 d后結(jié)果，皮屑持續(xù)增多并堆積成團(tuán)狀，且皮屑均未掉落，表明紅色毛癬菌仍在侵染其皮膚。結(jié)果表明含芳樟醇的凝膠劑可治療紅色毛癬菌引起的皮膚感染，能顯著控制紅色毛癬菌感染豚鼠的病程，發(fā)揮出與陽(yáng)性藥物相當(dāng)?shù)淖饔?，極具藥物開(kāi)發(fā)前景。

病理切片結(jié)果顯示正常豚鼠皮膚的表皮層和真皮層之間的層次明顯，且表皮層角化程度正常，皮膚棘層的厚度勻稱，毛囊的數(shù)量正常并有序分布，無(wú)融合和彌散。相反，模型組中的豚鼠皮膚則出現(xiàn)了炎癥反應(yīng)及組織被破壞的現(xiàn)象，表現(xiàn)為炎細(xì)胞浸潤(rùn)、表皮層的角質(zhì)化過(guò)度、棘層變得膨大、顆粒層的厚度增加，其毛囊也出現(xiàn)融合以及皮脂腺增多等現(xiàn)象。此外，陽(yáng)性組、芳樟醇組表皮層、真皮層的結(jié)構(gòu)正常，僅有輕微炎癥反應(yīng)，角化程度正常，棘層僅輕變?cè)龊?，顆粒層無(wú)明顯變化，毛囊無(wú)彌散和融合現(xiàn)象，表明豚鼠皮膚損傷得到恢復(fù)。見(jiàn)圖9。

圖9 各組豚鼠皮膚病理學(xué)變化. A(a).空白組；B(b).模型組；C(c).陽(yáng)性對(duì)照組；D(d).芳樟醇組(1.表皮；2.毛囊；3.顆粒層；4.棘層；5.皮脂腺；6.灶狀角質(zhì)化破損)Fig.9 Skin pathological changes of guinea pigs in each group. A(a). Blank group; B(b). model group; C(c). Positive control group; D(d). Linalool group (1. Epidermis; 2. Hair follicles; 3. Granular layer; 4. Spinous layer; 5. Sebaceous glands; 6. Focal keratinization damage)

3 討 論

芳樟醇是一種揮發(fā)精油，廣泛存在于植物的根莖花果中，其抗菌活性已被報(bào)道[11-12]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)芳樟醇對(duì)紅色毛癬菌具有較強(qiáng)的抑制作用，并通過(guò)改良CLSI M38-A2法測(cè)定芳樟醇抑制紅色毛癬菌的MIC為320 μg·mL-1，在該濃度下，芳樟醇可顯著抑制紅色毛癬菌的孢子萌發(fā)(62.88%)，抑制菌絲的徑向生長(zhǎng)高達(dá)88.27%，并且呈現(xiàn)劑量依賴性的方式產(chǎn)生作用。當(dāng)640 μg/mL芳樟醇濃度作用后，紅色毛癬菌的孢子萌發(fā)率僅為12.09%，菌絲幾乎未見(jiàn)徑向生長(zhǎng)。孢子作為真菌的主要繁殖器官，對(duì)于真菌菌絲的生長(zhǎng)以及真菌的繁殖具有重要作用，菌絲聚集組成了真菌的營(yíng)養(yǎng)體，有助于真菌獲取營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，芳樟醇作用紅色毛癬菌后可導(dǎo)致其菌絲萎縮、表面變粗糙、菌絲局部壞死等現(xiàn)象，有效遏制菌絲的生長(zhǎng)。細(xì)胞壁和細(xì)胞膜維持著細(xì)胞的完整性和正常的生命代謝功能，我們進(jìn)一步測(cè)定芳樟醇處理紅色毛癬菌之后的電導(dǎo)率變化證實(shí)了芳樟醇可以使紅色毛癬菌的細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，作用機(jī)制可能是芳樟醇疏水性較強(qiáng)，可能導(dǎo)致真菌細(xì)胞膜的脂質(zhì)分裂，破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)滲透壓失衡和細(xì)胞內(nèi)成分泄漏，可能與同屬單萜類化合物的香葉醇抗菌機(jī)制一致，其可通過(guò)破壞紅色毛癬菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的方式發(fā)揮抗真菌作用[13]。另外，透射電鏡也證明了芳樟醇可破壞紅色毛癬菌的細(xì)胞壁以及細(xì)胞膜等。麥角甾醇是真菌細(xì)胞膜的主要組成部分，它能夠維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性并且是細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)骨架[20]。研究證明芳樟醇可以抑制紅色毛癬菌細(xì)胞膜成分麥角甾醇的合成，使細(xì)胞膜穩(wěn)定性下降，細(xì)胞膜完整性受損。先前的研究發(fā)現(xiàn)特比萘芬可抑制角鯊烯環(huán)氧化酶的活性，使鯊烯不能環(huán)氧化，導(dǎo)致鯊烯大量積累，使麥角甾醇合成減少，從而抑制真菌生長(zhǎng)[21]，后續(xù)可進(jìn)一步探究芳樟醇作用后角鯊烯環(huán)氧化酶的活性變化，明確芳樟醇引起的細(xì)胞膜成分的改變及合成酶的活性變化等。此外，皮膚癬菌的致病機(jī)制較為復(fù)雜，且易傳染，因此在后續(xù)的研究中可進(jìn)一步研究芳樟醇抗紅色毛癬菌作用機(jī)制，如芳樟醇能否影響紅色毛癬菌細(xì)胞壁的合成與組裝，影響膜電位、線粒體的活性以及活性氧自由基的生成，對(duì)于深入了解芳樟醇抗紅色毛癬菌的機(jī)理以及抗真菌藥物的開(kāi)發(fā)有重要意義。

豚鼠常用于皮膚感染模型的建立，在本研究中，我們成功構(gòu)建了紅色毛癬菌感染的豚鼠模型，并以卡波姆為基質(zhì)制備了一種含芳樟醇的凝膠制劑。將其用于動(dòng)物感染的皮膚癬病的治療，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)給藥后能顯著控制紅色毛癬菌的感染狀況，改善皮膚損傷，顯示出與陽(yáng)性藥物特比萘芬凝膠相同的效果，證明芳樟醇對(duì)紅色毛癬菌的感染具有治療作用。另外，在更進(jìn)一步的研究中還可針對(duì)藥物載藥的劑型進(jìn)行研究，為臨床治療皮膚癬菌病奠定基礎(chǔ)。綜上，芳樟醇可能是控制皮膚癬病的一種潛在殺真菌劑，有助于將芳樟醇作為新型外用皮膚病藥物進(jìn)行開(kāi)發(fā)。