孟偉，黃佳星，郭旭東

（內(nèi)蒙古大學(xué)，內(nèi)蒙古呼和浩特 010070）

生物具有產(chǎn)生與自己相似或相同新個(gè)體的能力，這種能力被稱為生殖能力。生殖是物種延續(xù)的必要方式，也是所有生物的基本生理特征之一。但生殖能力在不同物種之間存在著極大的多樣性，大多數(shù)復(fù)雜的高等生物進(jìn)行有性生殖，即通過由親本產(chǎn)生的兩性生殖細(xì)胞結(jié)合形成受精卵，受精卵進(jìn)而發(fā)育成新個(gè)體，這種生殖方式在減少有害性狀的遺傳和增加環(huán)境適應(yīng)性方面具有顯著的進(jìn)化益處。然而在自然界中，一些低等植物、部分動(dòng)物中存在著一種同性生殖的方式——孤雌生殖?！肮麓粕场边@一概念最早在1894年由科學(xué)家Owen提出，指卵細(xì)胞具有發(fā)育成完整胚胎或個(gè)體的能力，且在這個(gè)過程中并不涉及精子[1]。具體可分為兩種類型[2]，一種是由物理化學(xué)方法激活卵子，發(fā)育過程中不涉及精子的純粹孤雌生殖；另一種是精子正常進(jìn)入卵細(xì)胞并將其激活，但精子的細(xì)胞核并不參與胚胎的發(fā)育，胚胎的發(fā)育僅在雌核的控制下進(jìn)行的孤雌生殖。與之相對應(yīng)的是孤雄生殖，是指僅由雄性個(gè)體提供生殖細(xì)胞，將兩個(gè)處理過的精子注入去核卵母細(xì)胞，從而獲得胚胎甚至單獨(dú)個(gè)體，這在自然界中幾乎不存在。在哺乳動(dòng)物中，同性生殖受到表觀遺傳基因組印記的限制，有些基因只在母本或父本基因組中表達(dá)，導(dǎo)致同性之間無法成功繁殖后代。

1 研究歷程與進(jìn)展

自20世紀(jì)90年代起，科學(xué)家們開始陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一些特殊的基因。對于大多數(shù)基因，它們的父系起源和母系起源的兩個(gè)等位基因具有相似轉(zhuǎn)錄活性，但隨著之后的研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物中有數(shù)百個(gè)基因的等位基因的表達(dá)因父系母系的來源不同而具有特異性，這些基因被稱為印記基因。

1984 年，科 學(xué) 家 James McGrath 和 Davor Solter James經(jīng)過對單細(xì)胞期胚胎核移植試驗(yàn)[3]，構(gòu)建了具備兩個(gè)雌性原核和兩個(gè)雄性原核的二倍體小鼠胚胎，證明了在胚胎中只有同時(shí)具有雙親染色體才能存活，同時(shí)表明父系基因組和母系基因組對胚胎發(fā)育的貢獻(xiàn)存在差異[3]。1991年后，科學(xué)家們幾乎在同一時(shí)期發(fā)現(xiàn)了三個(gè)對胚胎發(fā)育有重要影響印記基因:Igf2、Igf2r和 H19[4-6]。

2004年，日本東京農(nóng)業(yè)大學(xué)的河野友宏（Kono Tomohiro）教授利用未生長的卵母細(xì)胞核與成熟的卵母細(xì)胞核重建卵母細(xì)胞[8]，發(fā)現(xiàn)小鼠7號染色體上H19基因[8]和上游的差異甲基化區(qū)DMR序列[9]以及12號染色體上Dlk1-Gtl2基因間的DMR序列可阻礙孤雌胚胎印記基因的正常表達(dá)，從而導(dǎo)致孤雌胚胎發(fā)育能力受限[9]。之后，他們獲得全世界第一例由兩個(gè)母親所產(chǎn)生的哺乳動(dòng)物后代。

2009年，Hiromi Miki等[10]科學(xué)家將圓形精細(xì)胞注入去核卵母細(xì)胞，使二者融合并發(fā)育，之后在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)，可以獲得發(fā)育到囊胚期和妊娠中期的小鼠胚胎。但是，直到2018年之前，還沒有在哺乳動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)孤雄后代。

2018年，Nissim Benvenisty等[11]通過對單倍體胚胎干細(xì)胞進(jìn)行印記基因遺傳修飾，首次獲得由兩位父親產(chǎn)生的孤雄后代小鼠，以及通過對印記基因的敲除手段得到了由兩位母親所產(chǎn)生的表型基本正常的孤雌后代小鼠。本次研究中取得的突破性進(jìn)展是，在刪除了3個(gè)遺傳區(qū)域后，得到29只孤雌幼崽，且其中7只可以產(chǎn)生自己的后代；在刪除了7個(gè)遺傳區(qū)域后，兩只雄性小鼠來源的生殖細(xì)胞或干細(xì)胞結(jié)合得到了12只孤雄幼崽。但是，由兩個(gè)父親產(chǎn)生的后代幼鼠最終因呼吸困難、組織積液等生理異常僅存活了2天。上述研究結(jié)果揭示了一些重要的具有基因印記機(jī)制的遺傳區(qū)域，這些遺傳區(qū)域可以阻止哺乳動(dòng)物在沒有異性的情況下生殖。

2 生殖機(jī)理

2.1 孤雌生殖機(jī)理

2018年，Nissim Benvenisty等用人工激活未受精卵母細(xì)胞所衍生的、孤雌生殖單倍體胚胎干細(xì)胞（phESCs），成功地制備了孤雌小鼠[11]。其過程主要包括三步:（1）在2i培養(yǎng)基中培養(yǎng)單倍體胚胎干細(xì)胞，使細(xì)胞獲得廣泛低甲基化，包括擦除母體印記；（2）利用CRISPR-Cas9刪除單倍體胚胎干細(xì)胞中的一個(gè)或兩個(gè)父系印記區(qū)域（IG-DMR、H19-Igf2）；（3）將編輯過的單倍體胚胎干細(xì)胞注入成熟卵母細(xì)胞。結(jié)果顯示，單基因座缺失的幼鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重遲鈍并且在出生后不久死亡，而兩個(gè)基因座缺失的小鼠可存活至成年并且可繁育出后代。但是，這些小鼠仍然具有生長遲緩、行為異常、膽固醇水平降低和壽命延長等生理現(xiàn)象。之后，在分析這些小鼠的差異基因選擇性表達(dá)時(shí)，他們在精子中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)非常重要的印記基因——Rasgrf1[12]，然后對孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞中的Rasgrf1基因進(jìn)行敲除，并由此獲得的孤雌小鼠基本上與正常個(gè)體繁育出的小鼠一樣健康，而且可以繁育后代。

2.2 孤雄生殖機(jī)理

除了在制備與正常小鼠生理代謝功能基本已無差異的孤雌小鼠方面取得顯著進(jìn)展外，本次研究[11]最突出的亮點(diǎn)是，孤雄后代首次成功誕生并且實(shí)現(xiàn)短期存活。孤雄生殖因其十分復(fù)雜的生殖機(jī)理，在自然界中是一種難以自發(fā)實(shí)現(xiàn)的生殖方式。在雄性中，沒有相當(dāng)于孤雌胚胎發(fā)生中所使用的、無印記的未成熟卵母細(xì)胞，且由于注射了精子的去核卵母細(xì)胞具有父系起源和單倍體性，雄性單倍體胚胎干細(xì)胞在功能上可以替代卵母細(xì)胞注射中的精子，且因其具有廣泛低甲基化和類似于原始生殖細(xì)胞的狀態(tài)，所以其中所有親本印記都不存在。

因?yàn)槟赶涤∮浉鼮樨S富[13]，所以生產(chǎn)孤雄小鼠需要更多的基因敲除。最初他們[11]選擇了已知影響胚胎發(fā)育的六個(gè)印記基因:Nespas、Peg3、Snrpn、Kcnq1、Grb10和Igf2r，并將它們在低甲基化的雄性單倍體胚胎干細(xì)胞中刪除。將精子和六個(gè)基因座缺失的雄性單倍體胚胎干細(xì)胞共同注射到去核卵母細(xì)胞中，從而產(chǎn)生雄性二倍體胚胎干細(xì)胞。然而，六基因座缺失的孤雄小鼠的出生率極低，并在出生后會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的生理異常，例如過度生長、哺乳和呼吸困難等癥狀，不久之后就會(huì)死亡。為了提高雙雄原核小鼠的存活率，他們在上述基礎(chǔ)上又刪除了印記基因Gnas，結(jié)果七基因座缺失的孤雄小鼠出生率略高于六基因座缺失小鼠[11]。雖然這些小鼠僅有幾種表型的部分改善，但是12只孤雄幼仔在出生后僅存活了48 h。這一結(jié)果為培育健康孤雄生殖后代，并最終取得成功提供了有益的線索。

3 同性生殖的意義

3.1 研究孤雌生殖的意義

研究孤雌生殖有助于分析探討有性生殖與無性生殖的利弊關(guān)系。孤雌生殖的研究在進(jìn)化生物學(xué)和保護(hù)生物學(xué)領(lǐng)域都具有重要意義，利用孤雌生殖的遺傳學(xué)原理與機(jī)制，可以利用編輯已知遺傳區(qū)域產(chǎn)生無性克隆動(dòng)物，以增加其子代數(shù)目，并且還可以增加物種多樣性，在野生動(dòng)物保護(hù)方面有著十分重要的作用[14]。同時(shí)，人類孤雌生殖對于人類胚胎學(xué)上的研究具有重大意義，很多哺乳動(dòng)物的試驗(yàn)研究表明孤雌胚胎的發(fā)育過程與正常胚胎的發(fā)育過程幾乎相同。因此，可以利用孤雌胚胎作為人類胚胎學(xué)的研究模型，避免了有關(guān)倫理問題方面的限制。孤雌生殖的研究為人類治療性克隆方面開辟一條全新途徑，避免了因?yàn)槔萌祟惻咛ジ杉?xì)胞治療而引起的宗教、道德和倫理等問題。因此，孤雌發(fā)育體系的建立將為醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用帶來廣闊的應(yīng)用前景，它將為解決基因治療、器官移植、組織修復(fù)、疾病治療等領(lǐng)域的問題提供全新的選擇，并且發(fā)揮著極其重要的作用。

3.2 研究孤雄生殖的意義

我國會(huì)引進(jìn)優(yōu)質(zhì)牲畜品種，以提高當(dāng)?shù)仄贩N的生產(chǎn)性狀。然而，由于許多因素，最優(yōu)種公畜個(gè)體的引進(jìn)往往很難實(shí)現(xiàn)。相對而言，引進(jìn)最優(yōu)種公畜個(gè)體的精液較為容易，因?yàn)榫酉鄬Ω菀撰@得、保存、運(yùn)輸，并且無論是死精子還是活性較低的精子都可以通過顯微受精技術(shù)實(shí)施育種。而且從理論上來講，利用最優(yōu)種公畜精子，通過孤雄生殖生產(chǎn)后代可以得到遺傳物質(zhì)完全來自于優(yōu)質(zhì)品種的家畜后代[15]。沿著這個(gè)思路將以性染色體分離為基礎(chǔ)的性控育種技術(shù)與成熟的孤雄生殖技術(shù)結(jié)合，可以得到所需性別的優(yōu)質(zhì)家畜。這為培育優(yōu)良品種提供了一個(gè)新的思路和方法，在畜牧業(yè)方面具有不可估量的發(fā)展前途。

4 結(jié)語

通過對哺乳動(dòng)物的同性生殖研究，在探索哺乳動(dòng)物生殖方式以及生殖機(jī)理等領(lǐng)域的道路中發(fā)現(xiàn)了一種新的繁殖方式。通過同性生殖，可以得到具有較高科研價(jià)值和醫(yī)學(xué)價(jià)值的純系動(dòng)物。此外，在探索孤雌生殖和孤雄生殖小鼠的過程中，對不同印記區(qū)域的遺傳修飾的研究，可以視作是未來醫(yī)學(xué)領(lǐng)域臨床治療疾病的一個(gè)極具研究價(jià)值的初步探索。