劉凌沖

(長春科技學院，吉林長春 130600)

1 概述

1.1 溫度對物種生存的重要性

溫度對物種的生存、分布及數量有極大的影響，從分子生物學角度可以對溫度對物種分布的影響進行闡釋。在細胞和分子層面，輕微熱量的改變能造成深遠的影響，如細胞的酶活性、蛋白穩(wěn)定性和轉運、大分子聚合反應、細胞膜流動性、細胞分泌和神經信號傳遞等。在兩極地區(qū)，土層寒冷，全年的溫度都低于5℃。大片的土地都是凍土，只有夏天的幾周是解凍的土壤。微生物對溫度變化特別敏感，尤其在不同地區(qū)的溫度變化。影響生物生長的一個重要因素就是酶催化的適合溫度。每個酶的活性都有其最適溫度，低于最適溫度，有些催化反應的功能就會停止，當溫度逐漸上升，催化效率也隨之上升并趨近于最適溫度。溫度每提升10℃，催化反應速度翻一番。然而，超過一個固定點，再繼續(xù)升溫，生物的生長就會變慢，當溫度很高時甚至會致命。高溫對微生物的損害主要體現在酶變性、載體轉運過程破壞，并影響其他蛋白質功能。溫度對微生物細胞膜同樣有顯著的影響:在極低的溫度下，細胞膜會凝固；在高溫，磷脂雙分子層會溶解分離。

1.2 極端微生物

極端微生物是一種生活在極端的溫度、酸堿度和鹽度中的微生物的總稱，從中可以獲取一些極端條件下的酶用于生產和應用。極端微生物根據它們生長環(huán)境的不同和產生酶的應用的不同，可以將它們分為嗜熱菌、嗜酸菌、嗜堿菌、嗜冷菌和嗜壓菌。這些不同種類的極端微生物在地球的不同地方存在，海底、火山，兩極到赤道，地球最冷的和最熱的地方都有它們的存在。

1.3 嗜冷菌的特點及其重要性

區(qū)分嗜冷菌和冷耐受性菌是通過它們不同的生長溫度。嗜冷菌在0℃長勢良好；在15℃或者以下有最適增長，最大值在10℃左右。嗜冷菌來源于北冰洋和南極，因為90%的海洋都是5℃或高點，這是嗜冷菌的居住環(huán)境。嗜冷微生物在很多方面都適應了環(huán)境。

1.4 游仆蟲

終年寒冷的南極大陸沿岸海域擁有大量真核微生物，它們中的大部分是纖毛蟲屬，尤其是嗜冷微生物游仆蟲（Euplotesfocardii）。游仆蟲是研究生物適冷性的理想材料。游仆蟲隸屬原生動物門纖毛綱游仆科，是單細胞真核生物。由于它們結構簡單、易于操作、低溫條件易生存（最適生長溫度4～5℃）、容易在實驗室控制培養(yǎng)等特點，所以游仆蟲是研究冷適應性理想的工具。

2 材料與方法

2.1 供試材料

游仆蟲野生菌株TN1[6]是從南極洲特拉諾瓦灣沿岸水域的海水樣品和混沙沉積物中被分離出來的。

RNaseA，購自北京西美杰科技有限公司。

2.2 試劑與儀器

微量離心管（江蘇康健醫(yī)療、冷凍離心機（湖南凱達科學儀器有限公司）、異丙醇（上海滬靜生物科技有限公司）、乙醇（上海撫生實業(yè)有限公司）、考馬斯亮藍（上海華藍化學科技有限公司）、AquaPure Genomic DNA kits 732-6340上海天崛電子科技有限公司、SEDI梯度PCR儀（WEALTEC）、Mini GES迷你水平電泳槽（WEALTEC）、紫外分光光度記（Mettlertoledo）、SDS溶液（青島捷世康生物科技有限公司）。

2.3 游仆蟲Euplotesfocardii的培養(yǎng)

游仆蟲TN1野生株系是從南極Terra Nova沿岸水域的海水樣品和泥沙沉積物中被分離出來的。它的細胞是以Danaliellatertiolecta為食物并且在2～4℃增長。在此溫度下，細胞表現出顯著的增殖率。在鹽水中4-5℃被培養(yǎng)，在4℃繁殖率是大概每四天分裂一次。

2.4 游仆蟲Euplotesfocardii細胞基因組DNA的提取

使用純水基因組DNA試劑盒（AquaPureGeomic DNA）提取基因組DNA流程如下。

2.4.1 細胞收集

慢速離心已收集約2×106細胞，加入平衡后的35%NaCl溶液中，轉移入1.5mL離心管。于1600r/min離心5s以收集細胞。棄去上清液，留取20μL殘液。

2.4.2 細胞裂解

大力旋轉細胞懸浮顆粒。為了裂解細胞，將300μL 細胞裂解液（Genomic DNA lysis Solution）加入細胞懸浮液中，并且仔細得用移液管上下吸取數次以促進細胞裂解。

2.4.3 RNA酶處理

將1.5μL RNA酶A溶液4mg/mL加入細胞裂解液中。顛倒離心管25次，以徹底混合樣品并且在37℃培養(yǎng)1h。

2.4.4 蛋白質沉降

待樣品溫度降至室溫，將100μL蛋白質沉降溶液加入細胞裂解產物中。劇烈振蕩20s使蛋白質沉降溶液與細胞裂解產物充分融合。然后在1600r/min離心3min以分解沉淀蛋白和細胞碎片。

2.4.5 DNA沉降

將含有DNA的上清液轉移入新的滅菌處理的1.5mL離心管中，加入300μL100%異丙醇溶液并上下反復顛倒50次。然后在1600r/min將樣品離心1min以產出DNA白色沉淀，上清液被丟棄，DNA沉淀放在干凈的吸收紙風干。之后，加入300μL70%乙醇溶液以沖洗DNA沉淀并反復多次顛倒，并在1600r/min離心1min，然后棄去上層乙醇溶液。最后將試管倒置在干凈的濾紙上風干10～15min。

2.4.6 DNA溶解

DNA懸浮顆粒被干化，100μL DNA水溶液加入DNA懸浮顆粒液，并且在室溫下過夜培養(yǎng)以為了DNA水化。紫外光吸收范圍從260nm到280nm以測試DNA純度和質量，A260/A280在1.7～2.0。最后，DNA在-20℃儲存。

2.5 引物設計

PCR擴增中使用的引物見表1。

表1 引物設計

2.6 PCR擴增

針對兩個不同的引物，我們設置兩個循環(huán)

2.7 樣品DNA純化

2.7.1 調試DNA結合條件

混合1體積的樣品和2體積的NT緩沖液。

2.7.2 結合DNA

將核酸萃取物放入收集管中，裝滿樣品。在11000r/min離心1min，棄上清液于收集管中。

2.7.3 洗刷硅膠膜

加入600ulNT3緩沖液。在11000r/min離心1 min。棄去上清液重新將核酸萃取物放回收集管中。

2.7.4 干化硅膠膜

在11000r/min離心2min以除去NT3緩沖液，確保離心管無殘留液。由于包含乙醇的NT3緩沖液會影響下一步反應。所以要在72℃風干2～5min。

2.7.5 洗提DNA

將核酸萃取物放入干凈的1.5mL微量離心管中。加入15～50μLNE洗脫緩沖液或者離子水在室溫下靜置1 min以提高純化DNA的產量。然后再在11000r/min 離心 1 min。

2.7.6 跑電泳及基因測序

純化后的DNA沉淀用聚丙烯凝膠電泳（SDSPAGE）的方法跑出所需的基因條帶進行剪切，并拿到測序公司進行測序。利用測序后的序列結果進行特點分析。

3 結果

3.1 從游仆蟲中提取的GroES的序列分析

冷適應分子機制的研究，在基因表達和蛋白序列的層面。游仆蟲的轉錄子包含454個序列并用BLAST方法搜索分析出來。對應真核生物的GroES可以發(fā)現兩個重復的序列從這些重復序列，分析出兩個起始子:

>Ef_groES1 MSIAFKKLNPLLNRVLVKRAEAVTKT TGGIILTQEKDMSYGTVVAHGPGVAEESGFRTTCVKIG DTVLLPSWEGQGVELNGEELSIYRDTDIMGILSEEVL

>Ef_groES2 MLNFRRVQPLLNRVLVKKVEVAQKSI GGIILSARDTPPANIGTVIDVGPGTTDRDGKHRECFVNV GDVVLLPEHAGAKIELADESEFYLFRDDDIIGVLSDRI

3.2 冷適應性分析

>Ec_GroES1 MSISFKKLSPLLNRVLVKRAAASTTSA GGIILTEEKEMAYGEVVAHGPGVSEEGGFRDTCVKKG DTVLLPSWEGQKIELNGEELSIYRDTDILGILSEKVQ

>Ec_GroES2 MLNFRRIKPLMNRVLVKKVEVPSKSA GGILLKVTEAEKSNVATVIDVGPGTTDREGNFRKTFVNV GDIVLLPETQGRKIEMADKSEFYLYRDDDIIGVLSEAV

對比這些序列揭示了從游仆蟲中的兩個GroES序列只有45%相同，然而EFGroES1有80%與ECGroES1，EFGroES2有68%與它的厚游仆蟲的異源體相同。

4 結論

論文研究的目的是研究嗜冷微生物游仆蟲中提取的特異性功能基因分子伴侶GroES，并對其進行冷適應性分析。研究表明，從游仆蟲中提取的GroES基因表達蛋白質趨向于提升脯氨酸，天冬氨酸，組氨酸，和精氨酸的含量；降低谷氨酸，賴氨酸，絲氨酸，蘇氨酸和酪氨酸的含量。而脯氨酸、天冬氨酸、組氨酸等正是與微生物的抗凍性相關的蛋白質組成，提升這些氨基酸的同時也提高了多肽鏈分子的靈活性，這對在低溫下行使酶反應的性能非常重要。更多的實驗還需要驗證這個假設:如果是真的，就會提高細菌中蛋白質表達的含量，尤其是真核生物中的抗凍蛋白。以此生產更多的生物催化酶，通過原核生物的繁殖特性提高抗凍蛋白的工業(yè)生產的效率。