李慧，李月玲，邵喆

（寶船生物醫(yī)藥科技（上海）有限公司，上海 201203）

單克隆抗體類藥物作為生物制品的一類，具有特異性高、靶向性強(qiáng)和毒副作用低等特點(diǎn)，廣泛用于腫瘤、自身免疫病等多種疾病治療[1]。近些年，單抗藥物屬于最熱門的研發(fā)領(lǐng)域之一，每年的市場(chǎng)資金投入、藥物獲批數(shù)量都在急劇增長(zhǎng)。穩(wěn)定性考察是生物制品研發(fā)的重要組成部分，其包括影響因素研究、加速試驗(yàn)以及長(zhǎng)期試驗(yàn)的考察[2-5]，必要時(shí)還應(yīng)包括使用期間穩(wěn)定性的考察[6-7]。加速試驗(yàn)是在加速條件下進(jìn)行，通過加速藥物的化學(xué)或物理變化，探討藥物的穩(wěn)定性。長(zhǎng)期試驗(yàn)是在接近藥物的實(shí)際貯存條件下進(jìn)行，其目的是為制定藥物的有效期提供依據(jù)。影響因素研究是在比加速試驗(yàn)更激烈的條件下進(jìn)行，其目的是探討藥物的固有穩(wěn)定性、了解影響其穩(wěn)定性的因素及可能的降解途徑與降解產(chǎn)物，為產(chǎn)品生產(chǎn)、包裝、貯存條件和分析方法的開發(fā)及驗(yàn)證提供科學(xué)依據(jù)[5]。中國藥典（2015版）四部以及ICH相關(guān)指南中建議，生物制品在申報(bào)IND、生產(chǎn)規(guī)模擴(kuò)大以及工藝變更后，均需要考察產(chǎn)品的穩(wěn)定性。

本研究就生物制品穩(wěn)定性考察中的影響因素試驗(yàn)展開研究。研究對(duì)象為單抗藥物A003，A003是一個(gè)分子量為150 kD的全人源化的IgG1抗體，適應(yīng)癥為用于實(shí)體瘤的治療。本研究中，將考察樣品對(duì)光照、高溫、劇烈振蕩、異常環(huán)境溫度、酸堿破壞、氧化破壞等異常儲(chǔ)存條件的耐受程度，考察樣品的主要降解途徑及降解產(chǎn)物，為制定產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、儲(chǔ)存、運(yùn)輸條件提供試驗(yàn)依據(jù)，并據(jù)此進(jìn)一步驗(yàn)證所用分析方法的可行性，為后期選擇包裝材料提供參考。

1 材料及方法

1.1 試驗(yàn)材料

單克隆抗體A003，注射溶液劑，pH 6.0，20 mg/mL，10mL/支。

1.2 方法

影響因素試驗(yàn)包括光照、高溫、劇烈振蕩、低溫循環(huán)、凍融循環(huán)、酸堿破壞、氧化破壞等考察因素。具體考察方法及取樣時(shí)間點(diǎn)如下。

（1）光照試驗(yàn)。參考ICHQ1B指南[8]，將樣品放置于穩(wěn)定性綜合試驗(yàn)箱（LHH-250GSD-UV，上海一恒，下同），同時(shí)暴露在冷白熒光燈和近紫外燈下，光照強(qiáng)度設(shè)置為（4 500±5 000）lx，溫度設(shè)置為 10 ℃，在第0、4、8、14、30天取樣檢測(cè)。

（2）高溫試驗(yàn)。將樣品放置于穩(wěn)定性試驗(yàn)箱，溫度設(shè)置為40 ℃，避光，在第0、4、8、14、30天取樣檢測(cè)。

（3）劇烈振蕩試驗(yàn)。將樣品放置于25℃，轉(zhuǎn)速100 r/min，恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZHWY-Z11C，上海智誠）考察30天，第0、4、8、14、30天取樣檢測(cè)。

（4）低溫循環(huán)。將樣品于醫(yī)用冷藏箱（HYC-940，海爾），2～8 ℃放置2天，然后轉(zhuǎn)移至穩(wěn)定性綜合試驗(yàn)箱，（25±2）℃下放置2天，此為一個(gè)循環(huán)，放置三個(gè)循環(huán)，第0、4、8、12天取樣檢測(cè)。

（5）凍融循環(huán)。將樣品于醫(yī)用冷凍箱（DW-25L262，海爾），-20～-10 ℃放置2天，然后轉(zhuǎn)移至醫(yī)用冷藏箱（HYC-940，海爾），4 ℃下放置2天，此為一個(gè)循環(huán)，放置三個(gè)循環(huán)。第0、4、8、12天取樣檢測(cè)。

（6）酸破壞試驗(yàn)（pH3.0）。用50%醋酸將樣品pH調(diào)節(jié)到3.0，于室溫下第0、4、8、24 h取樣，取樣后用2 mol/L Tris將pH調(diào)整到6.0，然后檢測(cè)。

（7）堿破壞試驗(yàn)（pH9.5）。用 2 mol/L Tris將樣品pH調(diào)節(jié)到9.5，于室溫下第0、4、8、24 h取樣，取樣后用50%醋酸將pH調(diào)整到6.0，然后檢測(cè)。

（8）氧化破壞試驗(yàn)。取600 μL樣品，加入400 μL H2O2（2%）混勻，37 ℃條件下放置，室溫下第 0、1、2、3 h取樣，取樣后用空白緩沖液7000 G超濾換液去除殘留的H2O2，然后檢測(cè)。

1.3 檢測(cè)項(xiàng)目

檢測(cè)項(xiàng)目包括:外觀、pH值、蛋白質(zhì)含量、滲透壓摩爾濃度、離子交換色譜、分子排阻色譜、CE-SDS還原電泳、CE-SDS非還原電泳、cIEF、抗原結(jié)合活性和細(xì)胞水平活性等。

pH值、蛋白質(zhì)含量、滲透壓摩爾濃度分別用pH計(jì)（FE28，METTLER），紫外分光光度計(jì)（UV-1900，島津），滲透壓測(cè)定儀（SMC 30C-1，天津天河）檢測(cè)。

離子交換色譜（Cation Exchange Chromatography，CEX）:采用 HPLC（Agilent 1260）、陽離子交換色譜柱MabPacTMSCX-10（Thermo），蛋白樣品進(jìn)樣后，經(jīng) 流 動(dòng) 相 A（20 mmol/L Tris，pH 8.1）、流動(dòng)相 B（20 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，pH 8.1）進(jìn)行鹽離子梯度洗脫，帶電荷組分分子會(huì)根據(jù)帶正電荷由少到多的順序被洗脫出來，經(jīng)紫外檢測(cè)器（280 nm）檢測(cè)，從而達(dá)到分析樣品電荷異質(zhì)性的目的。

分 子 排 阻 色 譜（Size Exclusion Chromatography，SEC）:采用 HPLC（Agilent 1260）、TSKgel G3000SWXL色譜柱（TOSOH），經(jīng)流動(dòng)相（100 mmol/L KH2PO4/ 100 mmol/L Na2SO4，pH6.7±0.02）等 度 洗 脫 20 min，按照分子大小依次被洗脫，經(jīng)紫外檢測(cè)器（280 nm）檢測(cè)。該方法可達(dá)到分析樣品分子大小異質(zhì)性的目的。

CE-SDS還原電泳:使用毛細(xì)管電泳儀（PA800，Beckman-Coulter），樣品經(jīng)β-巰基乙醇（Sigma-Aldrich）還原成重鏈和輕鏈，在毛細(xì)管（Beckman-Coulter）中依據(jù)分子量大小進(jìn)行分離，經(jīng)PDA檢測(cè)器檢測(cè)，從而達(dá)到定量測(cè)定產(chǎn)品純度及非糖基化重鏈的目的。

CE-SDS非還原電泳:使用毛細(xì)管電泳儀（PA800，Beckman-Coulter），蛋白在非還原條件下，在毛細(xì)管（Beckman-Coulter）中依據(jù)分子量大小進(jìn)行分離，從而達(dá)到定量測(cè)定重組單抗產(chǎn)品純度的目的。

毛細(xì)管等電聚焦（Capillary Isoelectric Focusing，cIEF）:采用毛細(xì)管電泳儀（iCE3，ProteinSimple）檢測(cè)抗體的等電點(diǎn)以及分析其電荷異質(zhì)性。在電場(chǎng)作用下，樣品、兩性電解質(zhì)和緩沖液混合物能在毛細(xì)管內(nèi)形成穩(wěn)定的pH梯度，當(dāng)具有不同等電點(diǎn)（pI）的蛋白質(zhì)在電場(chǎng)作用下遷移時(shí)，將聚焦在pH等于其等電點(diǎn)的位置，形成窄的聚焦區(qū)帶。iCE3全柱成像檢測(cè)系統(tǒng)會(huì)在聚焦過程中實(shí)時(shí)采集信號(hào)，形成等電聚焦圖譜。

抗原結(jié)合活性:采用間接ELISA原理，在96孔板中包被可特異性結(jié)合樣品的一抗（Sino Biological），并依次加入梯度稀釋的樣品和酶結(jié)合二抗（Sigma），用酶底物顯色法（TMB，購自北京索萊寶）檢測(cè)樣品與一抗的結(jié)合量，用酶標(biāo)儀（MD，thermo）讀取數(shù)值，以樣品濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，反應(yīng)樣品與一抗結(jié)合量的OD值為縱坐標(biāo)，擬合出一條四參數(shù)曲線。通過比較待測(cè)樣品和參比品的IC50值，計(jì)算待測(cè)品的抗原結(jié)合活性。

細(xì)胞水平活性:采用報(bào)告基因法進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)藥物作用機(jī)理選擇合適的信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子，構(gòu)建一個(gè)靶啟動(dòng)子位于熒光素酶表達(dá)基因序列前方的報(bào)告基因質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，獲得反應(yīng)細(xì)胞。當(dāng)抗體加入反應(yīng)體系時(shí)，信號(hào)通路被激活，轉(zhuǎn)錄因子與靶啟動(dòng)子結(jié)合，則熒光素酶基因就會(huì)表達(dá)，引起熒光發(fā)光，熒光強(qiáng)度與抗體濃度呈正相關(guān)。以抗體濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，相應(yīng)濃度下熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)擬合出四參數(shù)曲線，獲得樣品和參比品的EC50值，用于計(jì)算樣品的相對(duì)細(xì)胞水平活性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本研究所采用分析方法均經(jīng)過方法驗(yàn)證，通常認(rèn)為含量和純度與初始值相差5%，或者生物活性指標(biāo)超過70%～130%的范圍判為顯著變化。其他指標(biāo)的變化關(guān)注變化趨勢(shì)。

2 結(jié)果與分析

各影響因素試驗(yàn)的外觀都沒有變化，無色、澄清。其余結(jié)果見表1-表8。

2.1 光照試驗(yàn)結(jié)果

光照試驗(yàn)結(jié)果見表1，考察至30天，CEX主峰由56.6%降低至50.1%，酸性峰比例由33.8%上升至42.9%。cIEF的變化趨勢(shì)與離子交換色譜結(jié)果的變化趨勢(shì)一致。

表1 光照試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.2 高溫試驗(yàn)結(jié)果

高溫試驗(yàn)結(jié)果見表2，考察至30天，CEX主峰由56.6%降低至38.2%，酸性峰比例由33.8%上升至51.7%，cIEF變化趨勢(shì)于CEX一致；SEC單體比例由99.5%降低至98.4%，聚體比例略有升高；非還原CE-SDS的主峰比例由97.6%降低至94.4%。其余結(jié)果無明顯變化。

表2 高溫（40 ℃）試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.3 劇烈振蕩試驗(yàn)結(jié)果

劇烈振蕩試驗(yàn)結(jié)果見表3，CEX、cIEF主峰比例略有降低，其余各項(xiàng)指標(biāo)無明顯變化。

表3 劇烈振蕩試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.4 低溫循環(huán)試驗(yàn)結(jié)果

低溫循環(huán)試驗(yàn)結(jié)果見表4，各項(xiàng)指標(biāo)均無明顯變化。

表4 低溫循環(huán)試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.5 凍融循環(huán)試驗(yàn)結(jié)果

凍融循環(huán)試驗(yàn)結(jié)果見表5，各項(xiàng)指標(biāo)均無明顯變化。

表5 凍融循環(huán)試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.6 酸破壞試驗(yàn)結(jié)果

酸破壞試驗(yàn)結(jié)果見表6，各項(xiàng)指標(biāo)均無明顯變化。

表6 酸破壞試驗(yàn)數(shù)據(jù)（pH 3.0）

2.7 堿破壞試驗(yàn)結(jié)果

堿破壞試驗(yàn)結(jié)果見表7，各項(xiàng)指標(biāo)均無明顯變化?？疾熘?4 h，CEX主峰比例明顯降低，由56.1%降至50.2%，酸性峰比例明顯升高。其他指標(biāo)無明顯變化。cIEF的變化趨勢(shì)與CEX一致。

表7 堿破壞試驗(yàn)數(shù)據(jù)（pH9.5）

2.8 氧化破壞試驗(yàn)結(jié)果

氧化破壞試驗(yàn)結(jié)果見表8，氧化破壞至3 h，非還原CE-SDS主峰由96.4%降低至71.9%，CEX主峰由54.8%降低至25.3%，酸性峰比例顯著升高。cIEF主峰由57.9%降低至29.4%，抗原結(jié)合活性、細(xì)胞水平活性結(jié)果已由107%、110%分別降低至43%、42%。

表8 氧化破壞試驗(yàn)數(shù)據(jù)

3 分析及討論

影響因素試驗(yàn)通常是生物制品考察穩(wěn)定性的第一步，包括溫度、光照、濕度、振搖、低溫循環(huán)、凍融循環(huán)、酸堿破壞和氧化破壞等。通過這一系列的考察，了解產(chǎn)品對(duì)哪些考察因素比較敏感，哪些質(zhì)量屬性變化比較大，了解產(chǎn)品的主要降解產(chǎn)物及降解途徑，進(jìn)一步驗(yàn)證所用分析方法的可行性，為后期產(chǎn)品的儲(chǔ)存、運(yùn)輸、包裝材料的選擇、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。因此，做好影響因素試驗(yàn)考察非常重要。

本研究針對(duì)單抗藥物A003展開影響因素試驗(yàn)研究，結(jié)果表明:（1）A003對(duì)高溫、光照、氧化破壞比較敏感，電荷異質(zhì)性發(fā)生了顯著的變化，表現(xiàn)為主峰比例顯著下降，酸性峰比例顯著升高；純度變化表現(xiàn)為單體比例有明顯下降趨勢(shì)，聚體比例有明顯升高趨勢(shì)。在氧化破壞試驗(yàn)中，生物活性指標(biāo)降低顯著；（2）劇烈振蕩對(duì)A003有輕微破壞，電荷異質(zhì)性變化趨勢(shì)明顯，主峰比例有降低的趨勢(shì)，酸性峰比例有升高的趨勢(shì)；（3）A003在其他因素考察試驗(yàn)中，沒有明顯變化。

在影響因素考察中發(fā)現(xiàn)，最敏感的考察項(xiàng)目是CEX、cIEF。這兩項(xiàng)也是最常用的分析單抗電荷異質(zhì)性的方法，根據(jù)出峰時(shí)間先后分為酸性峰、主峰和堿性峰。一般認(rèn)為N糖基化、C末端賴氨酸丟失、氨基酸氧化、天冬酰胺脫酰胺化及天冬氨酸異構(gòu)化、N末端谷氨酰胺及谷氨酸環(huán)化是較常見的產(chǎn)生電荷異質(zhì)性的原因[9]。電荷異質(zhì)性也是影響抗體活性的重要因素，有研究表明高水平的唾液酸化會(huì)影響單抗與FcγRIIIa的結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致ADCC活性減弱[10]。此外，天冬酰胺脫酰胺化可以發(fā)生在抗體的恒定區(qū)或可變區(qū)，當(dāng)發(fā)生在可變區(qū)，可能對(duì)抗體的結(jié)合活性產(chǎn)生一定的影響[11]，還沒有明確的證據(jù)證明C末端賴氨酸丟失、蛋氨酸氧化、N末端谷氨酸或谷氨酰胺環(huán)化對(duì)抗體會(huì)造成影響[12]。盡管大多數(shù)電荷變異體對(duì)抗體的生物學(xué)活性無顯著影響，但當(dāng)電荷變異值接近一個(gè)pI單位時(shí)，可能影響藥物的組織分布和藥代動(dòng)力學(xué)[13]。因此，盡量控制電荷異質(zhì)性的變化，對(duì)于產(chǎn)品的安全性、有效性至關(guān)重要。

在影響因素考察中，另外一個(gè)敏感指標(biāo)是純度。雖然抗體藥物在最初生產(chǎn)出來時(shí)，因經(jīng)過一系列的純化過程，最終都是高純產(chǎn)物，但是在產(chǎn)品儲(chǔ)存、運(yùn)輸以及給患者的使用過程中，純度會(huì)降低，都會(huì)產(chǎn)生不可逆的聚體[14]。聚體的存在（無論是人源化的還是全人源的蛋白），會(huì)顯著增加引起病人對(duì)藥物起免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，在極少數(shù)情況下，可能引起嚴(yán)重的安全問題[15]。聚體通常保留原來單體的二級(jí)結(jié)構(gòu)或者三級(jí)結(jié)構(gòu)的一部分，還具有不可逆性。這兩個(gè)特征組合起來，使得聚體更容易引起免疫原性[16-17]。因此，為保證單抗產(chǎn)品的有效性及安全性，因嚴(yán)格控制聚體的產(chǎn)生。

生物學(xué)活性是決定抗體在治療疾病中是否有效的重要條件。本研究中氧化破壞，引起A003生物學(xué)活性的顯著降低，應(yīng)該盡量避免。

綜上所述，引起A003明顯破壞的影響因素是高溫、光照、氧化；引起A003輕微變化的影響因素是劇烈振蕩、堿破壞；易引起變化的質(zhì)量屬性是電荷異質(zhì)性、純度、生物學(xué)活性。因此，產(chǎn)品在儲(chǔ)存、運(yùn)輸過程中應(yīng)盡量避免接觸空氣，避免高溫及光照的條件。