陳歡，蔡小旭，劉志清

(三峽大學(xué)人民醫(yī)院·宜昌市第一人民醫(yī)院，湖北宜昌443000)

微纖維蛋白相關(guān)糖蛋白2(MAGP2)是一種相對(duì)分子質(zhì)量為25 kD，主要定位于細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的蛋白，其N端的RGD結(jié)構(gòu)域能夠與ECM中的彈性纖維等分子發(fā)生交聯(lián)，調(diào)節(jié)ECM的結(jié)構(gòu)和功能，介導(dǎo)細(xì)胞的黏附和運(yùn)動(dòng)[1]。MAGP2是ECM影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵媒介分子，尤其能在不同類型細(xì)胞中特異性地激活或抑制Notch信號(hào)通路[1～3]。MAGP2已被證實(shí)與多種腫瘤(舌癌、乳腺癌、膽管細(xì)胞癌)的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[4～8]。結(jié)直腸癌(CRC)是消化系統(tǒng)腫瘤主要類型，近年來(lái)在我國(guó)居民中的發(fā)病率逐漸攀升[9]。尋找新的CRC標(biāo)志物，可能會(huì)為CRC提供新的診治靶點(diǎn)。MAGP2在CRC組織中的表達(dá)變化國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究探索MAGP2在正常結(jié)直腸組織和CRC腫瘤組織中的表達(dá)差異及意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年7月～2018年1月本院病理科留存手術(shù)切除的CRC組織及其正常結(jié)直腸組織50例份，均經(jīng)病理檢查確診，術(shù)前均未接受放化療。其中CRC患者男35例、女25例，平均年齡54.2歲，結(jié)腸癌取材48例、直腸癌取材12例。對(duì)患者進(jìn)行隨訪，統(tǒng)計(jì)5年生存率。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得豁免知情同意文件。

1.2 CRC組織與正常結(jié)直腸組織中MAGP2蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法。石蠟切片、脫蠟、水化后，用PBS緩沖液(湖北百奧斯生物科技有限公司)洗2次(每次5 min)，用蒸餾水或PBS緩沖液配置新鮮的3% H2O2，室溫封閉5～10 min，用蒸餾水洗3次進(jìn)行抗原修復(fù)。之后再用PBS緩沖液漂洗5 min，滴加山羊血清封閉液(湖北百奧斯生物科技有限公司)，室溫封閉20 min，甩去多余液體。一抗(MAGP2抗體，Abcam，1∶1 000)室溫孵育1 h。之后吸去一抗，用PBS緩沖液洗3次，每次2 min。用二抗(湖北百奧斯生物科技有限公司)室溫孵育20 min。PBS洗3次，每次2 min，滴加試劑SABC，室溫靜止20 min。之后PBS緩沖液洗凈后用DAB(湖北百奧斯生物科技有限公司)顯色。脫水、透明、封閉、鏡檢。根據(jù)染色強(qiáng)度分為強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性、陰性。強(qiáng)陽(yáng)性為高表達(dá)，弱陽(yáng)性、陰性為低表達(dá)。

1.3 CRC組織與正常結(jié)直腸組織中MAGP2 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR法。用TRIzol(Invitrogen)法提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA(Bio-Rad)。設(shè)計(jì)并合成目的基因和內(nèi)參的引物后，使用無(wú)RNase 的雙蒸水將引物稀釋至10 μmol/L，之后建立25 μL 的PCR反應(yīng)體系：cDNA 4 μL，正向引物(深圳華大基因股份有限公司)1 μL，反向引物(深圳華大基因股份有限公司)1 μL，2×SYBR Green master mix(湖北百奧斯生物科技有限公司)12.5 μL，用無(wú)RNase 的雙蒸水將反應(yīng)體系調(diào)整至25 μL，上機(jī)(Bio-Rad)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。MAGP2正向引物5′-AACTTAAGCTTGGTACATGTCGCTCTTGGGACC-3′，反向引物5′-GCCACTGTGCTGGATTCACAGACCATTGGGTCTC-3′；β-actin正向引物5′-CATTAAGGAGAAGCTGTGCT-3′，反向引物5′-GTTGAAGGTAGTTTCGTGGA-3′。PCR反應(yīng)體系：90 ℃預(yù)變性5 min；90 ℃變性15 s，65 ℃退火15 s，75 ℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)；75 ℃再延伸5 min。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt法。mRNA相對(duì)表達(dá)量上調(diào)2倍為表達(dá)上調(diào)[10]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 7軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；預(yù)后分析采用Log-rank法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRC組織與正常結(jié)直腸組織中MAGP2表達(dá)比較 CRC組織內(nèi)MAGP2蛋白定位于ECM，且呈強(qiáng)信號(hào)，正常結(jié)直腸組織內(nèi)未見(jiàn)明顯MAGP2表達(dá)。CRC組織中MAGP2蛋白高表達(dá)81.7%(49/60)，低表達(dá)18.3%(11/60)；正常結(jié)直腸組織中MAGP2蛋白低表達(dá)13.3%(8/60)，無(wú)高表達(dá)。CRC組織中MAGP2蛋白表達(dá)與正常結(jié)直腸組織比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨機(jī)選擇CRC組織與正常結(jié)直腸組織各10例，CRC組織中MAGP2 mRNA表達(dá)上調(diào)占90%(9/10)。

2.2 MAGP2蛋白高表達(dá)與CRC患者臨床病理特征的關(guān)系 MAGP2蛋白高表達(dá)的CRC患者Dukes分期高(P=0.048)、腫瘤分化水平低(P=0.034)、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.036)。見(jiàn)表1。

2.3 MAGP2蛋白表達(dá)與CRC患者預(yù)后的關(guān)系 MAGP2蛋白低表達(dá)患者的5年生存率為64%(7/11)，而MAGP2蛋白高表達(dá)患者的5年生存率為53%(26/49)，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

3 討論

MAGP2的突變或異常表達(dá)與人類多種疾病相關(guān)，MAGP2的突變可能影響血管彈性纖維的功能，參與主動(dòng)脈夾層形成的病理過(guò)程[10]；MAGP2在脂肪組織中可能扮演了ECM重塑和炎癥調(diào)控的角色，參與了肥胖和多種代謝相關(guān)疾病的發(fā)生[11,12]。

腫瘤微環(huán)境可與腫瘤細(xì)胞相互作用，為腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移提供適合的環(huán)境。腫瘤微環(huán)境中的ECM被認(rèn)為是細(xì)胞生命活動(dòng)的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)器。ECM通過(guò)以下機(jī)制影響細(xì)胞過(guò)程。一方面ECM可調(diào)控腫瘤微環(huán)境中各類分子配體、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞趨化因子及基質(zhì)降解酶的濃度和活性[13，14]；另一方面，ECM蛋白質(zhì)組成和交聯(lián)決定了腫瘤微環(huán)境的物理性質(zhì)，如結(jié)構(gòu)、剛性等，這影響了腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移潛能[15～17]。MAGP2是ECM的重要組分，其可能是CRC的癌基因。既往研究發(fā)現(xiàn)，MAGP2在舌癌組織中可激活下游MAPK和AKT信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性表型[6]；MAGP2在乳腺癌組織中能夠調(diào)節(jié)下游基質(zhì)金屬蛋白酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶9、焦點(diǎn)黏附激酶、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶等通路或分子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[4,5]。在CRC組織中，MAGP2也可能介導(dǎo)前述信號(hào)通路和分子的激活或表達(dá)。Notch是腫瘤組織中常見(jiàn)的異常激活通路，Notch與CRC細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成和耐藥均有緊密聯(lián)系[18～21]。雖然目前尚無(wú)文獻(xiàn)證實(shí)腫瘤組織中MAGP2是否可以調(diào)控Notch，但鑒于MAGP2具有調(diào)節(jié)Notch活性的結(jié)構(gòu)域，MAGP2-Notch軸可能在CRC發(fā)生發(fā)展中具有重要意義。另外，MAGP2在CRC中的癌基因角色也可能與其調(diào)控整合素信號(hào)通路相關(guān)。整合素是一類廣泛分布于細(xì)胞表面的糖蛋白分子，與胞外基質(zhì)黏附形成黏著斑，為信號(hào)蛋白提供信號(hào)傳導(dǎo)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，與腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移等過(guò)程密切相關(guān)[22，23]。有研究表明，MAGP2在內(nèi)皮細(xì)胞中通過(guò)RGD結(jié)構(gòu)域與整合素受體結(jié)合，調(diào)控其下游分子的激活[1，2]。本研究結(jié)果顯示，MAGP2蛋白在CRC組織中主要定位于腫瘤間質(zhì)，其表達(dá)高于正常結(jié)直腸組織，且其高表達(dá)與患者臨床病理特征及預(yù)后相關(guān)，提示MAGP2可能為CRC的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

表1 MAGP2蛋白高表達(dá)與CRC患者臨床病理特征的關(guān)系(例)

綜上所述，MAGP2可能為CRC新的診斷標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)。其在CRC惡性表型中的功能和作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究闡明。