鄧濤，龔建平，何堃

(1重慶市永川區(qū)中醫(yī)院，重慶402160；2重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院)

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)已成為全球范圍內(nèi)的慢性肝臟疾病，其以肝細(xì)胞游離脂肪酸(FFA)沉積、肝細(xì)胞損傷、小葉內(nèi)炎癥為特征[1]。肥胖、代謝異常、2型糖尿病、高血壓及血脂異常等是NASH發(fā)生發(fā)展的高危因素[2,3]。NASH患者肝臟存在廣泛脂毒性，主要以大量脂肪酸沉積，導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)總膽固醇、甘油三酯水平升高，F(xiàn)FA的利用和攝取失衡，肝細(xì)胞損傷，炎癥因子釋放，最終導(dǎo)致NASH[2,4]。其疾病發(fā)展走向?yàn)閺腘ASH到肝硬化，甚至發(fā)展為肝癌[4]。目前國際上認(rèn)為單純性脂肪肝(NAFLD)對人體不足以造成不可逆轉(zhuǎn)的危害，屬于良性病變，但一旦發(fā)展為NASH，就很有可能發(fā)展為肝癌[5,6]。NASH是NAFLD發(fā)展過程中的關(guān)鍵步驟。有研究提出NASH的發(fā)生發(fā)展與“二次打擊”學(xué)說有關(guān)[7,8]。促炎因子白細(xì)胞介素1β(IL-1β)的分泌與點(diǎn)頭樣受體3(NLRP3)炎癥小體的激活密切相關(guān)，而NLRP3炎癥小體的激活又與高脂飲食脂肪酸的大量攝入有關(guān)[7,9]。NLRP3炎癥小體通過各種信號通路控制IL-1β的成熟和分泌，導(dǎo)致肝臟慢性炎癥的發(fā)生發(fā)展。IL-1β導(dǎo)致的肝臟慢性代謝性炎癥在NAFLD向NASH的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，是肝臟脂質(zhì)代謝紊亂的重要影響因素[10,11]。2017年1月～2018年3月，本研究探討NLRP3炎癥小體在NASH小鼠發(fā)病過程中的確切作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及儀器 雄性野生型(WT)C57BL/6小鼠20只，6～8周齡，體質(zhì)量(20±2)g；雄性NLRP3基因敲除(NLRP3-/-)小鼠20只，6～8周齡，體質(zhì)量(20±2)g。小鼠均為清潔級，均購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。NLRP3-/-小鼠在重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心自行繁殖，實(shí)驗(yàn)操作符合重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)及國家相關(guān)法律規(guī)定。氨酸膽堿缺乏的飼料購于美國Research diets公司，Western blotting所用抗體及IL-1β檢測試劑盒購于Abcam公司，免疫熒光所用共聚焦顯微鏡為Nikon C1+。

1.2 動(dòng)物分組及飼養(yǎng)方法 用普通飼料(ND組，n=10)與蛋氨酸膽堿缺乏的飼料(MCD組，n=10)分別喂養(yǎng)WT小鼠、NLRP3-/-小鼠4周，喂養(yǎng)結(jié)束后經(jīng)眼球取血，分離血清。處死小鼠，取其肝臟。

1.3 肝組織病理變化觀察 采用蘇木素伊紅(HE)染色法。取肝組織放入甲醛溶液中固定48 h，用石蠟包埋，制作切片，按照HE染色說明書進(jìn)行染色，鏡下觀察肝組織病理變化。

1.4 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、FFA及IL-1β檢測 將血清標(biāo)本從-80 ℃冰箱取出，放在冰上逐漸融化，用速率法檢測ALT及AST水平，用酶法檢測FFA水平，用ELISA法檢測IL-1β水平。

1.5 肝組織中NLRP3、ASC及半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(Cleaved-Caspase-1)蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。配制SDS-PAGE凝膠，把蛋白樣品和maker上樣到凝膠加樣孔內(nèi)，電泳液進(jìn)行電泳，用電轉(zhuǎn)液轉(zhuǎn)膜，BSA封閉，用相應(yīng)抗體孵育一抗過夜，洗膜3次，用相應(yīng)二抗孵育，洗膜3次，顯影儀上顯影。目標(biāo)蛋白相對表達(dá)量=目標(biāo)蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組肝組織病理變化比較 ND組WT小鼠肝細(xì)胞無脂肪變，排列整齊，無炎癥細(xì)胞浸潤，肝血竇間隙正常；MCD組WT小鼠肝細(xì)胞脂肪變明顯，排列紊亂，胞質(zhì)疏松呈空泡狀，部分細(xì)胞核腫脹，脂滴將肝細(xì)胞核擠壓至胞質(zhì)的邊緣。ND組NLRP3-/-小鼠肝細(xì)胞同WT小鼠ND組，而MCD組NLRP3-/-小鼠肝組織損傷程度較MCD組WT小鼠明顯減輕，肝細(xì)胞氣球樣變及炎癥細(xì)胞浸潤均不明顯。

2.2 各組血清ALT、AST、FFA、IL-1β水平比較 MCD組WT小鼠血清ALT、AST水平較ND組高(P均<0.05)；MCD組NLRP3-/-小鼠血清ALT、AST水平較ND組高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。MCD組WT小鼠與NLRP3-/-小鼠血清FFA水平均較ND組高(P均<0.05)。MCD組WT小鼠血清IL-1β水平較ND組高(P均<0.01)，NLRP3-/-小鼠血清IL-1β水平較ND組高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1各組血清ALT、AST、FFA、IL-1β水平比較

2.3 各組肝組織中NLRP3、ASC及Caspase-1蛋白表達(dá)比較 MCD組WT小鼠肝組織中NLRP3、ASC和Cleaved-Caspase-1蛋白表達(dá)較ND組高(P均<0.05)，MCD組NLRP3-/-小鼠ASC、Cleaved-Caspase-1蛋白表達(dá)與ND組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 各組肝組織中NLRP3、ASC及Cleaved-Caspase-1蛋白表達(dá)比較

3 討論

代謝性炎癥在NASH的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[12,13]。有研究發(fā)現(xiàn)，NASH的發(fā)生發(fā)展與多種因素有關(guān)，包括飲食、環(huán)境因素、先天免疫因素、肝細(xì)胞損傷、細(xì)胞凋亡等。在通常情況下細(xì)胞維持內(nèi)外環(huán)境平衡，當(dāng)炎癥因子的活化和抑制失衡，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)受損，細(xì)胞損傷，從而發(fā)生疾病[14～16]。有研究認(rèn)為，Kupffer細(xì)胞(KCs)中NLRP3炎癥小體和IL-1β信號通路的激活在NASH的發(fā)生發(fā)展起重要作用[17,18]。

NLRP3炎癥小體由NLRP3、ASC、Caspase-1組成[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機(jī)體受到FFA等刺激時(shí)，機(jī)體NLRP3活化增高，促進(jìn)IL-1β分泌，這一過程是導(dǎo)致NASH形成的關(guān)鍵[20]。NLRP3炎癥小體多在KCs胞質(zhì)中表達(dá)，而KCs是NASH發(fā)展過程中的關(guān)鍵細(xì)胞，且大量存在于肝臟中[21～23]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MCD飼料誘導(dǎo)的NASH小鼠肝臟組織中FFA、NLRP3、IL-1β高表達(dá)。FFA可作為觸發(fā)NLRP3炎癥小體活化的扳機(jī)，導(dǎo)致肝臟組織中NLRP3表達(dá)增高。血清中FFA水平增高，刺激KCs分泌大量促炎因子IL-1β，對肝臟細(xì)胞造成炎癥損傷[24,25]。

NLRP3在炎癥活化過程中起關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MCD飼料可誘導(dǎo)WT小鼠NASH形成，敲除小鼠NLRP3基因可以明顯抑制MCD飼料導(dǎo)致的小鼠NASH形成，減輕肝臟損傷。MCD飼料喂養(yǎng)的WT小鼠血清ALT、AST升高，可見其肝細(xì)胞受到損傷；而NLRP3-/-小鼠血清ALT、AST升高不明顯，血清中促炎因子IL-1β水平亦明顯下降，可見NLRP3-/-可以明顯減輕MCD飼料導(dǎo)致的肝細(xì)胞損傷，減輕肝組織炎癥程度，阻止NASH形成。

Cleaved-Caspase-1是Caspase激活后具有催化活力的產(chǎn)物。本研究結(jié)果表明，NASH小鼠肝組織中NLRP3、ASC及Cleaved-Caspase-1蛋白表達(dá)增加，而NLRP3-/-小鼠肝組織中表達(dá)降低。證實(shí)NLRP3在NASH的形成過程中發(fā)揮重要作用。Henao-Mejia等[26]研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3-/-小鼠發(fā)展為更加嚴(yán)重的NASH，該結(jié)果的發(fā)生與體內(nèi)腸道益生菌紊亂有關(guān)，該研究結(jié)果與本研究結(jié)果不同。有研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3的激活可能存在活性氧自由基(ROS)的產(chǎn)生，溶酶體的損傷，鉀離子的刺激這三種機(jī)制[27]。鉀離子、溶酶體、ROS的穩(wěn)態(tài)失衡會(huì)導(dǎo)致線粒體的功能紊亂，而細(xì)胞內(nèi)線粒體的功能狀態(tài)，與NLRP3炎癥小體的激活有密切關(guān)系[27,28]。

眾所周知，線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷(ATP)的主要場所，線粒體能夠合成ATP為細(xì)胞活動(dòng)供應(yīng)能量，參與細(xì)胞信息傳遞和細(xì)胞凋亡等過程[29,30]。而有研究指出持續(xù)的ROS過氧化反應(yīng)不僅可通過誘導(dǎo)磷脂酸的過氧化反應(yīng)從而導(dǎo)致線粒體膜電位的紊亂，還能促進(jìn)KCs釋放炎癥因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)和IL-1β[29,31]。目前認(rèn)為線粒體氧化應(yīng)激是NLRP3炎癥小體激活的三種可能機(jī)制的聚集點(diǎn)。最近有研究證實(shí)巨噬細(xì)胞在受到NLRP3炎癥小體激動(dòng)劑ATP刺激后，線粒體出現(xiàn)功能受損，并釋放出氧化線粒體DNA(mtDNA)，氧化mtDNA與NLRP3結(jié)合，并導(dǎo)致NLRP3炎癥小體的激活，導(dǎo)致促炎因子IL-1β大量分泌，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，NASH的形成[32]，其中mtDNA在NLRP3炎癥小體的激活過程中發(fā)揮核心作用；而當(dāng)小鼠敲除NLRP3基因后，在其肝臟巨噬細(xì)胞胞質(zhì)中未發(fā)現(xiàn)氧化mtDNA，并且IL-1β的分泌也明顯減少，敲除小鼠NLRP3基因后，MCD飼料喂養(yǎng)的小鼠NASH形成不明顯。因此，推測FFA可能通過作用于KCs中線粒體，導(dǎo)致其功能損傷，釋放的氧化mtDNA與NLRP3炎癥小體結(jié)合，并激活NLRP3炎癥小體。氧化mtDNA可能為介導(dǎo)FFA激活NLRP3炎癥小體的重要中間介質(zhì)。

本研究結(jié)果表明FFA可促進(jìn)肝臟NLRP3表達(dá)增高及NLRP3炎癥小體激活，促進(jìn)促炎因子IL-1β的分泌，從而誘導(dǎo)WT小鼠NASH形成。敲除小鼠NLRP3基因可明顯減輕炎癥反應(yīng)，阻止NASH的發(fā)生發(fā)展。NLRP3有望成為抑制NASH發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵靶點(diǎn)。但本研究也有一定局限性，未探討NLRP3導(dǎo)致肝臟NASH形成的確切機(jī)制。NLRP3可通過線粒體等來影響肝臟狀態(tài)，后期研究將重點(diǎn)探討NASH形成過程中NLRP3炎癥小體激活的確切機(jī)制。