嚴(yán)蘋，柏超，周翔宇，陳霞

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州646000)

急性胰腺炎(AP)發(fā)病后，釋放各種炎癥介質(zhì)，使腸黏膜通透性增強(qiáng)，導(dǎo)致腸黏膜屏障功能損傷，引發(fā)腸源性內(nèi)毒素血癥，誘發(fā)或加重胰腺的改變，發(fā)生“二次打擊”，進(jìn)一步導(dǎo)致多器官功能衰竭及嚴(yán)重感染。高遷移率族蛋白1(HMGB1)作為一種重要的晚期炎癥介質(zhì)，近年來(lái)其在AP中的作用日益受到關(guān)注及重視，但在臨床AP患者腸黏膜屏障損傷中的作用尚需進(jìn)一步探討。本研究觀察AP患者血清中HMGB1、TOLL樣受體(TLR)4、TLR9、二胺氧化酶(DAO)等的水平變化，探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年4月～2016年4月就診于本院消化內(nèi)科的AP患者59例，均發(fā)病<24 h，男38例、女22例，年齡22～66歲；依照《中國(guó)急性胰腺炎診治指南》(2013)[1]和AP亞特蘭大分類標(biāo)準(zhǔn)修訂(2012)[2]將患者分為輕型AP(MAP)組26例、中度重癥AP(MSAP)組17例、重癥AP(SAP)組16例。排除標(biāo)準(zhǔn)：發(fā)病超過(guò)24 h，患有肝炎、皰疹等病毒感染性疾?。幌到y(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾?。粣盒阅[瘤；有糖尿病史；其他與AP無(wú)關(guān)的嚴(yán)重器質(zhì)性病變。選擇同期于本院體檢健康的志愿者20例為對(duì)照組，男13例、女7例，年齡28～61歲。各組性別、年齡具有可比性。

1.2 血清HMGB1、TLR4、TLR9、IL-6、TNF-α、DAO檢測(cè) 患者于入院24、48、72 h及對(duì)照組于體檢24、48、72 h，使用促凝管分別抽取兩組靜脈血3 mL，均在室溫下靜置1～2 h，于4 ℃下3 000 r/min離心15 min。將所取得的血清置于-80 ℃冰箱凍存。使用ELISA試劑盒(武漢貝茵萊公司)檢測(cè)血清HMGB1、TLR4、TLR9、IL-6、TNF-α、DAO，按說(shuō)明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時(shí)間點(diǎn)血清HMGB1水平比較 詳見(jiàn)表1。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)血清HMGB1水平比較

注：與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05；與MAP組同時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.05；與MSAP組同時(shí)間點(diǎn)比較，△P<0.05；與同組入院48 h比較，★P>0.05。

2.2 各組不同時(shí)間點(diǎn)血清TLR4水平比較 詳見(jiàn)表2。

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)血清TLR4水平比較

注：與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05；與MAP組同時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.05；與MSAP組同時(shí)間點(diǎn)比較，△P<0.05；與同組入院48 h比較，★P>0.05。

2.3 各組不同時(shí)間點(diǎn)血清TLR9水平比較 詳見(jiàn)表3。

表3 各組不同時(shí)間點(diǎn)血清TLR9水平比較

注：與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05；與MAP組同時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.05；與MSAP組同時(shí)間點(diǎn)比較，△P<0.05；與同組入院48 h比較，★P>0.05。

2.4 各組不同時(shí)間點(diǎn)血清IL-6水平比較 詳見(jiàn)表4。

表4 各組不同時(shí)間點(diǎn)血清IL-6水平比較

注：與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05；與MAP組同時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.05；與MSAP組同時(shí)間點(diǎn)比較，△P<0.05。

2.5 各組不同時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α水平比較 詳見(jiàn)表5。

表5 各組不同時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α水平比較

注：與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05；與MAP組同時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.05；與MSAP組同時(shí)間點(diǎn)比較，△P<0.05。

2.6 各組不同時(shí)間點(diǎn)血清DAO水平比較 詳見(jiàn)表6。

表6 各組不同時(shí)間點(diǎn)血清DAO水平比較

注：與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05；與MAP組同時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.05；與MSAP組同時(shí)間點(diǎn)比較，△P<0.05；與同組入院48 h比較，★P>0.05。

2.7 AP患者血清HMGB1水平與DAO的相關(guān)性 AP患者血清HMGB1水平與DAO呈正相關(guān)(r=0.908，P<0.05)。

3 討論

AP早期腸道作為全身炎癥反應(yīng)的一個(gè)重要靶器官，腸黏膜屏障損害所致的腸道細(xì)菌或毒素移位是SAP細(xì)菌入侵的主要途徑。AP尤其是SAP，釋放大量的炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子不僅引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙，還可進(jìn)一步損傷腸黏膜屏障功能。本研究結(jié)果顯示，AP患者炎癥因子TNF-α、IL-6水平升高，SAP患者升高更明顯，但在起病24 h后逐漸下降，可見(jiàn)炎癥因子水平變化可反映疾病的嚴(yán)重程度。

HMGB1是一種廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞核內(nèi)的非組蛋白，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的惟一能在胞外誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌和活化炎癥細(xì)胞DNA結(jié)合的蛋白，核內(nèi)HMGB1可通過(guò)炎癥細(xì)胞的主動(dòng)分泌和壞死細(xì)胞的被動(dòng)釋放轉(zhuǎn)移至胞外，是重要的炎癥介質(zhì)[3]。近年來(lái)Meta分析結(jié)果表明AP患者血清中HMGB1水平升高，HMGB1可作為AP的生物學(xué)指標(biāo)之一[4]?，F(xiàn)有研究顯示，AP小鼠小腸黏膜組織中HMGB1水平升高，說(shuō)明HMGB1參與了AP時(shí)腸黏膜損傷。DAO是一種含有脫胺的腐胺和組胺的細(xì)胞內(nèi)酶，存在于人和哺乳動(dòng)物的小腸黏膜和纖毛上皮細(xì)胞中，以空、回腸活性最高，正常人血清中含量很低；腸黏膜細(xì)胞受損、壞死后該酶釋放入血，導(dǎo)致血清DAO活性增高，測(cè)定血中DAO的活性可反映腸黏膜損傷和修復(fù)的情況[5]。本研究采用DAO作為評(píng)估腸黏膜屏障的血清學(xué)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)AP患者存在腸黏膜損傷，SAP患者損傷更明顯。本研究發(fā)現(xiàn)， AP患者血清HMGB1水平均較對(duì)照組高，起病48 h達(dá)峰值，MSAP及SAP患者血清HMGB1水平在起病72 h仍維持在較高水平。進(jìn)一步相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)AP患者血清中HMGB1水平與DAO呈正相關(guān)，提示HMGB1可能參與了AP患者腸黏膜屏障損傷的發(fā)生發(fā)展。

HMGB-1屬于損傷相關(guān)性模式分子(DAMPs)中的一種重要分子。DAMPs可以激活Toll樣受體、NOD樣受體等模式識(shí)別受體。其中Toll樣受體被認(rèn)為是啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的“門戶”蛋白。TLR4可與巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞分泌的HMGB1結(jié)合，招募髓系分化蛋白88和IL-1受體相關(guān)激酶，再與下游調(diào)節(jié)因子TRAF結(jié)合，進(jìn)而激活MAPK途徑和核轉(zhuǎn)錄因子的核轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[6]。近年來(lái)有報(bào)道[7]指出HMGB1-DNA復(fù)合體可激活TLR9信號(hào)通路，通過(guò)激活NF-κB或JAK/STAT通路高度活化，促進(jìn)免疫細(xì)胞進(jìn)一步成熟和分泌細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α)等。有研究表明，TLR4在SAP初期參與了機(jī)體炎癥反應(yīng)，并導(dǎo)致SAP惡化[8]，而TLR9拮抗劑預(yù)處理的AP小鼠其胰腺壞死和肺的炎癥均有不同程度的減輕，TLR4、TLR9通過(guò)各自相應(yīng)的信號(hào)通路可使NF-κB活化，促使TNF-α、IL-1、IL-6等表達(dá)增加[9，10]，造成腸道自身免疫損傷。因此，本研究同時(shí)檢測(cè)了HMGB1的下游受體TLR4、TLR9，結(jié)果顯示，AP各組血清TLR4、TLR9水平較對(duì)照組升高，且在起病48 h達(dá)峰值，但MSAP及SAP患者在起病72 h仍維持較高水平。因此，HMGB1有可能通過(guò)激活下游受體TLR4、TLR9參與了AP時(shí)的腸黏膜屏障損傷。