陳思，張富新*，王畢妮，邵玉宇，曹斌云

1(陜西師范大學(xué) 食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安，710119)2(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌，712100)

羊乳富含蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖、礦物質(zhì)、維生素以及多種生物活性物質(zhì)，營養(yǎng)組成更接近母乳，是一種易被人體消化吸收的天然營養(yǎng)食品。由于羊乳的蛋白質(zhì)組成與牛乳有較大差別，在加工過程中存在一定難度，尤其是在超高溫瞬時(shí)滅菌(ultra-high temperature instantaneous sterilization，UHT)處理過程中，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性差，易出現(xiàn)蛋白質(zhì)沉淀現(xiàn)象[1]。為了提高羊乳的熱穩(wěn)定性，通常采用添加穩(wěn)定性鹽[2]、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)組成[3]等方法進(jìn)行處理，這些方法雖然對羊乳熱穩(wěn)定性有明顯改善，但也會(huì)存在一定的安全隱患。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(transglutaminase, TGase)處理也可有效提高羊乳的熱穩(wěn)定性。

TGase是一種能催化蛋白質(zhì)間?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的酶，在蛋白質(zhì)間形成共價(jià)鍵，促進(jìn)蛋白質(zhì)的交聯(lián)[4]，可改善蛋白質(zhì)食品的保水性、黏彈性、穩(wěn)定性等功能特性，已在肉制品、乳制品、水產(chǎn)品、大豆制品等富含蛋白食品中廣泛應(yīng)用[5-6]。乳中蛋白是TGase的良好底物[7]，通過TGase交聯(lián)可有效改善乳制品的熱穩(wěn)定性、凝膠化、持水性、黏度、乳化性等功能性質(zhì)[8]。TGase交聯(lián)作用受乳成分的影響較大，乳中的蛋白質(zhì)主要由酪蛋白和乳清蛋白組成，酪蛋白由于其開放結(jié)構(gòu)，易被TGase交聯(lián)，而乳清蛋白的球狀結(jié)構(gòu)不易被交聯(lián)，但對乳清蛋白適當(dāng)?shù)淖冃蕴幚?，可顯著提高TGase的交聯(lián)作用[9]。同時(shí)乳中還存在天然TGase抑制劑[10-11]，能夠抑制TGase的活性，這種抑制劑對熱敏感，通過熱處理可有效清除。熱處理是目前乳制品加工的必經(jīng)過程，不但可殺滅食品中有害微生物，保障食品安全，同時(shí)可使乳中乳清蛋白變性，滅活乳中的天然抑制劑。因此，本文通過研究羊乳的預(yù)熱處理促進(jìn)TGase對羊乳蛋白的交聯(lián)，提高羊乳的熱穩(wěn)定性，進(jìn)而為液態(tài)羊乳產(chǎn)品的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊乳，西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場新鮮羊乳；谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(活性100 u/g)，江蘇一鳴生物科技有限公司；Nα-CBZ-Gln-Gly和L-谷氨酸-γ-單羥氧肟酸，美國Sigma公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，Solarbio公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-S4型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；Z206A臺(tái)式離心機(jī)，西安中團(tuán)生物科技有限公司；BI-90Plus激光粒度分析儀，美國布魯克海文儀器公司；EYEL4真空冷凍干燥機(jī)，上海愛朗儀器有限公司；MULTISKAN GO全波長酶標(biāo)儀，美國熱電公司；Power PacTM基礎(chǔ)電泳儀電源和Mini-Protean?Tetra Cell電泳槽，美國BIO-RAD公司；ChemiDoc-It?510化學(xué)發(fā)光成像儀，美國UVP公司。

1.3 羊乳熱穩(wěn)定性的測定

羊乳熱穩(wěn)定性的測定采用Fox[12]毛細(xì)管法，用熱凝固時(shí)間(heat coagulation time，HCT)表示。將羊乳在3 500×g下離心20 min去除脂肪。取60 μL的樣品密封于玻璃毛細(xì)管中，浸入140 ℃恒溫油浴中加熱，并不時(shí)旋轉(zhuǎn)玻璃毛細(xì)管，記錄從開始加熱到羊乳沉淀出現(xiàn)掛壁現(xiàn)象所需的時(shí)間，即為羊乳的熱凝固時(shí)間。

1.4 TGase活性的測定

TGase活性的測定采用Crossowicz比色法[13]。以Nα-CBZ-Gln-Gly為作用底物，L-谷氨酸-γ-單羥氧肟酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(y= 0.061 3x+ 0.046 8，R2= 0.999 2)。TGase酶活定義為37 ℃時(shí)每分鐘催化生產(chǎn)1 μmol的L-谷氨酸-γ-單羥氧肟酸所需的酶量。

將預(yù)熱處理的羊乳用3 mol/L HCl調(diào)pH至4.2[14]，在15 000×g下離心15 min，去除沉淀的酪蛋白，將上清液用10 kDa濾膜(Amicon)超濾后，除去乳清蛋白[15]，得到無乳蛋白的上清液，用于TGase活性的測定。

將試劑A(稱100 mg Nα-CBZ-Gln-Gly溶于2 mL 0.2 mol/L NaOH溶液中，加入2 mL 0.1 mol/L鹽酸羥胺、2 mL 0.01 mol/L還原型谷胱甘肽、4 mL 0.2 mol/L pH 6.0 Tris-HCl緩沖液)、試劑B(3 mol/L HCl、12% 三氯乙酸、5% FeCl3·6H2O按1∶1∶1體積比混合)在37 ℃下保溫15 min。取0.4 mL無乳蛋白上清液，配制成0.01 g/mL的TGase液，添加1 mL試劑A在37 ℃下反應(yīng)10 min，然后加0.4 mL試劑B終止反應(yīng)5 min，4 000×g離心5 min，取上清液，在525 nm處比色，測定吸光值。用TGase酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TGase活性及殘留酶活百分率。

(1)

式中：U，酶活，μmol/min；A，525 nm處的吸光度值；N，酶稀釋倍數(shù)；10，反應(yīng)時(shí)間，min；V，參加反應(yīng)的酶體積，mL。

(2)

式中：U0，預(yù)處理前的TGase酶活，μmol/min；Ui，預(yù)處理后的TGase酶活，μmol/min。

1.5 酪蛋白膠束粒徑的測定

將處理后的乳樣在3 500×g下離心去除上層脂肪，取10 mL脫脂乳，用去離子水進(jìn)行1∶10稀釋，用BI-90Plus激光粒度分析儀在25 ℃下測定乳樣中的膠束粒徑。儀器參數(shù)設(shè)置為：分散介質(zhì)：水；黏度：0.890 mPa·s；折光系數(shù)：1.330。

1.6 乳清蛋白變性率的測定

參照趙麗麗[16]的方法，將預(yù)熱處理的乳樣用1 mol/L HCl調(diào)整pH至4.2，在室溫下靜置10 min，然后在15 000×g下離心15 min去除酪蛋白，上清液為無酪蛋白液。在無酪蛋白液中加入15%的三氯乙酸(質(zhì)量濃度)，使三氯乙酸最終濃度為12%，在3 500×g下離心使其乳清蛋白沉淀，上清液為非蛋白氮液。用自動(dòng)凱氏定氮儀分別測定處理后的非酪蛋白氮(NCN)和非蛋白氮(NPN)的含量，然后計(jì)算乳清蛋白氮(WPN)和乳清蛋白變性率。

WPN=NCN-NPN

(3)

(4)

1.7 SDS-PAGE

參照LAEMMLI[17]的方法，通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析羊乳蛋白質(zhì)的交聯(lián)程度。將羊乳樣品用雙蒸水稀釋15倍，取1份上樣緩沖液與3份樣品稀釋液混合均勻，在沸水浴中加熱3～5 min使蛋白質(zhì)變性，在12 000×g下離心5 min，取上層溶液為上樣液。配制13.5%的分離膠(2.25 mL 30%丙烯酰胺(質(zhì)量濃度)、1.25 mL pH 8.8 三(羥甲基)氨基甲烷(tris-HCl)、50 μL 10%十二烷基硫酸鈉(SDS)(質(zhì)量濃度)、50 μL 10%過硫酸銨(APS)(質(zhì)量濃度)、5 μL四甲基乙二胺(TEMED)和1.4 mL雙蒸水)和3.75%濃縮膠(0.313 mL 30%丙烯酰胺(質(zhì)量濃度)、0.313 mL pH 6.8 tris-HCl、25 μL 10% SDS(質(zhì)量濃度)、37.5 μL 10% APS(質(zhì)量濃度)、3.75 μL TEMED和1.813 mL雙蒸水)，完成制膠階段。在電泳槽內(nèi)加入電極緩沖液(3.03 g tris、18.7 g甘氨酸、1 g SDS定容至1 L)。取7 μL上樣液添加到上樣孔中進(jìn)行電泳，開始電泳電壓為75 V，當(dāng)溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后將電壓調(diào)至200 V，電泳40 min。將凝膠從玻璃板取下，在水平搖床中用染色液(1 g考馬斯亮藍(lán)R-250、450 mL甲醇、100 mL冰乙酸定容至1 L)染色2 h。染色后的凝膠用脫色液(甲醇:冰乙酸:雙蒸水的體積比為1∶1∶8)搖床脫色，至蛋白質(zhì)條帶清晰為止，最后用Chemi Doc-It化學(xué)成像系統(tǒng)掃描進(jìn)行灰度分析。

1.8 數(shù)據(jù)處理方法

采用Excel 2016對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和圖表編輯；采用DPS 9.50統(tǒng)計(jì)分析軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 預(yù)熱處理對羊乳熱穩(wěn)定性的影響

將羊乳在60、70、80、90 ℃下分別處理10～60 min，添加TGase使羊乳中TGase濃度達(dá)到3 u/g蛋白質(zhì)，在40 ℃保溫2 h，測定其熱凝固時(shí)間(HCT)，結(jié)果見圖1。

圖1 預(yù)熱處理對羊乳HCT的影響Fig.1 Effect of preheat treatment on HCT of goat milk

由圖1可知，用TGase催化羊乳蛋白交聯(lián)提高其熱穩(wěn)定性與預(yù)熱處理?xiàng)l件密切相關(guān)，隨著預(yù)熱處理溫度的提高和處理時(shí)間的延長，羊乳HCT值逐漸增加，熱穩(wěn)定性提高。但預(yù)熱處理?xiàng)l件對羊乳的熱穩(wěn)定性影響較大，在60～70 ℃預(yù)熱處理時(shí)，羊乳的HCT緩慢上升；而當(dāng)預(yù)熱處理溫度高于80 ℃時(shí)，羊乳的HCT顯著提高，表明預(yù)熱處理可有效地提高羊乳的熱穩(wěn)定性。大量研究表明，乳的熱穩(wěn)定性與TGase對乳蛋白的交聯(lián)度有關(guān)，乳蛋白交聯(lián)程度越大，乳的熱穩(wěn)定性越高[18]。但乳蛋白交聯(lián)程度與乳蛋白存在狀態(tài)有關(guān)，尤其是乳中天然存在的球狀乳清蛋白，通常不易被TGase交聯(lián)[7]。同時(shí)乳中存在天然的TGase抑制劑[19-20]，影響TGase對乳蛋白的交聯(lián)效果，預(yù)熱處理提高羊乳的熱穩(wěn)定性可能與TGase抑制劑和乳清蛋白變性有關(guān)。

2.2 預(yù)熱處理對羊乳中TGase抑制劑的影響

將羊乳在60、70、80、90 ℃分別處理5、10、20、30、60 min后，在羊乳中添加0.01 g/mL的TGase，在37 ℃下保溫15 min，測定羊乳中TGase的活性，計(jì)算殘留酶活百分率，并以未經(jīng)預(yù)熱處理的羊乳為對照，結(jié)果如圖2。

由圖2可知，當(dāng)羊乳未經(jīng)預(yù)熱處理時(shí)，羊乳中殘留TGase的活性僅為所添加TGase活性的37.4%，表明羊乳中存在天然的TGase抑制劑，抑制TGase對乳蛋白的交聯(lián)。然而羊乳經(jīng)預(yù)熱處理后，殘留的酶活性顯著提高，當(dāng)羊乳在60、70、80、90 ℃下預(yù)熱處理5 min后，羊乳中殘留酶活百分率分別達(dá)到56.55%、61.27%、78.35%、83.75%，與未經(jīng)預(yù)熱處理的對照組相比，殘留TGase活性分別提高了19.15%、23.87%、40.95%、46.35%，表明羊乳預(yù)熱處理可有效滅活羊乳中TGase抑制劑。同時(shí)可以看出，羊乳中TGase活性與預(yù)熱處理溫度和時(shí)間有關(guān)，當(dāng)羊乳在80～90 ℃處理30 min時(shí)，羊乳中殘留TGase活性幾乎達(dá)到100%，而在60～70 ℃預(yù)熱處理60 min時(shí)，羊乳中殘留TGase活性才能達(dá)到100%，這表明羊乳在80～90 ℃處理30 min或在60～70 ℃處理60 min才完全使羊乳中TGase抑制劑失活。DE JONG[10]報(bào)道，牛乳中TGase抑制劑對熱處理敏感，在80 ℃以上熱處理即可使TGase抑制劑滅活，這與本研究結(jié)果一致。

圖2 預(yù)熱處理對羊乳中TGase殘留酶活的影響Fig.2 Effect of preheat treatment on residual TGase activity in goat milk

2.3 預(yù)熱處理對羊乳乳清蛋白變性率的影響

將羊乳在60、70、80、90 ℃下分別預(yù)熱處理30 min，測定其乳清蛋白變性率，結(jié)果見圖3。

圖3 預(yù)熱處理對羊乳乳清蛋白變性率的影響Fig.3 Effect of preheat on the denaturation of whey protein in goat milk

由圖3可知，預(yù)熱處理溫度對羊乳乳清蛋白變性率有顯著的影響，隨著預(yù)熱溫度的升高，乳清蛋白變性程度顯著提高(P<0.05)。羊乳經(jīng)60 ℃預(yù)熱處理后有12.77%的乳清蛋白變性，而在80 ℃預(yù)熱處理后有68.1%的乳清蛋白變性，80～90 ℃處理乳清蛋白變性程度變化不大(P>0.05)。乳中的乳清蛋白是一種熱敏性蛋白質(zhì)，在80 ℃以上熱處理時(shí)極易變性，同時(shí)變性的乳清蛋白會(huì)與酪蛋白膠束結(jié)合，加速乳清蛋白的變性，這種變性的乳清蛋白更有利于TGase的交聯(lián)[21]，提高羊乳的熱穩(wěn)定性。

2.4 預(yù)熱處理對羊乳酪蛋白膠束粒徑的影響

將羊乳分別在60、70、80、90 ℃下預(yù)熱處理30 min后立即冷卻至40 ℃，添加TGase使其濃度達(dá)到3 u/g蛋白質(zhì)，在40 ℃下保溫2 h，測定羊乳中酪蛋白膠束粒徑，結(jié)果如圖4所示。

圖4 預(yù)熱處理對羊乳酪蛋白膠束粒徑的影響Fig.4 Effect of preheat on the size of casein micelles of goat milk

由圖4可以看出，未經(jīng)TGase處理的羊乳酪蛋白膠束平均為117.6 nm，且不受預(yù)熱處理的影響(P>0.05)，但羊乳經(jīng)60～90 ℃預(yù)熱處理后，TGase對羊乳中酪蛋白膠束粒徑影響較大，且隨著預(yù)熱處理溫度的升高，酪蛋白膠束粒徑逐漸增大(P<0.05)，MARTIN[22]研究表明，乳中酪蛋白在TGase交聯(lián)時(shí)，僅發(fā)生分子內(nèi)交聯(lián)，酪蛋白膠束粒徑無明顯變化，而羊乳經(jīng)預(yù)熱處理時(shí)，由于乳清蛋白變性與酪蛋白膠束結(jié)合會(huì)形成較大的膠束[23]，使TGase交聯(lián)后酪蛋白粒徑增大。

2.5 預(yù)熱處理對羊乳蛋白質(zhì)交聯(lián)的影響

將羊乳在60、70、80、90 ℃下分別預(yù)熱5 min和30 min，添加TGase使其濃度為3 u/g蛋白質(zhì)，40 ℃保溫2 h，用還原性SDS-PAGE電泳分析預(yù)熱處理對TGase催化羊乳蛋白質(zhì)交聯(lián)的影響。

乳的熱穩(wěn)定性與乳中酪蛋白膠束狀態(tài)有關(guān)，酪蛋白膠束是由αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白構(gòu)成的復(fù)合物，其中κ-酪蛋白位于膠束表面，對膠束穩(wěn)定性起關(guān)鍵作用[24]，當(dāng)乳經(jīng)熱處理時(shí)，位于表面的κ-酪蛋白易解離，使乳的穩(wěn)定性降低[21]，但當(dāng)酪蛋白膠束經(jīng)TGase交聯(lián)后，可使κ-酪蛋白膠束在受熱時(shí)穩(wěn)定，不易從膠束表面脫離，從而提高乳的熱穩(wěn)定性。SDS-PAGE電泳是將交聯(lián)后的酪蛋白膠束解離成單體酪蛋白，反映乳蛋白的交聯(lián)程度。羊乳蛋白質(zhì)在TGase作用下的交聯(lián)情況見圖5。

a-SDS-PAGE電泳圖；b-預(yù)熱溫度對單體蛋白質(zhì)相對含量的影響圖5 預(yù)熱處理對TGase交聯(lián)羊乳蛋白質(zhì)的影響Fig.5 Effect of preheat treatment on cross-linked goat milk protein with TGase 注：M為標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量，范圍是14.4～116 kDa；1為未經(jīng)預(yù)熱處理和未經(jīng)TGase處理的脫脂羊乳；2為未預(yù)熱處理，但經(jīng)過3 u/g TGase在40 ℃下處理2 h的羊乳；3為未經(jīng)TGase處理，但經(jīng)過80 ℃ 30 min預(yù)熱處理的羊乳；4、5分別為60 ℃預(yù)熱5、30 min，3 u/g TGase在40 ℃下處理2 h的羊乳；6、7分別為70 ℃預(yù)熱5、30 min，3 u/g TGase在40 ℃下處理2 h的羊乳；8、9分別為80 ℃預(yù)熱5、30 min，3 u/g TGase在40 ℃下處理2 h的羊乳；10、11分別為90 ℃預(yù)熱5、30 min，3 u/g TGase在40 ℃下處理2 h的羊乳。

由圖5可以看出，羊乳中的4種酪蛋白(αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白)和2種乳清蛋白(α-乳白蛋白、β-乳球蛋白)在SDS-PAGE電泳中，可明顯分離，形成清晰的條帶。同時(shí)可以看出，經(jīng)預(yù)熱處理后，TGase交聯(lián)形成的高分子質(zhì)量蛋白條帶。未經(jīng)預(yù)熱處理和未經(jīng)TGase處理的羊乳(條帶1)與未經(jīng)預(yù)熱處理、但經(jīng)TGase處理的羊乳(條帶2)相比，其4種酪蛋白和2種乳清蛋白條帶的色度無明顯變化，也未見高分子質(zhì)量蛋白條帶的形成，同時(shí)未經(jīng)TGase處理、但經(jīng)預(yù)熱處理的羊乳(條帶3)同樣沒有高分子質(zhì)量蛋白條帶的形成，這進(jìn)一步證實(shí)羊乳中存在天然的TGase抑制劑，抑制TGase對乳蛋白的交聯(lián)。但經(jīng)預(yù)熱和TGase同時(shí)處理的羊乳中蛋白質(zhì)組成和高分子質(zhì)量蛋白條帶有一定變化，表明預(yù)熱處理可促進(jìn)乳蛋白的交聯(lián)。

當(dāng)羊乳經(jīng)預(yù)熱處理后，TGase對羊乳中蛋白的交聯(lián)程度有一定的差別，尤其是當(dāng)羊乳經(jīng)80 ℃以上預(yù)熱處理后(條帶8、9、10、11)，κ-酪蛋白條帶色度明顯降低，同時(shí)發(fā)現(xiàn)形成的高分子質(zhì)量條帶明顯增多，而αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白和β-酪蛋白條帶色度變化不大。同時(shí)發(fā)現(xiàn)乳清蛋白中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的色度有不同程度的降低，經(jīng)條帶灰度分析，羊乳經(jīng)80 ℃預(yù)熱處理30 min時(shí)，κ-酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白分別降低44.86%、31.33%和21.39%，這表明TGase對羊乳中蛋白交聯(lián)是有選擇性的，主要交聯(lián)羊乳酪蛋白中的κ-酪蛋白和乳清蛋白中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。RODRIGUEZ-NOGALES[25]研究表明，乳中酪蛋白對TGase交聯(lián)敏感性不同，其中κ-酪蛋白處于酪蛋白膠束表面，易被TGase交聯(lián)，而位于酪蛋白膠束內(nèi)部的αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白和β-酪蛋白交聯(lián)程度較低，這與本研究結(jié)果一致。關(guān)于乳清蛋白，由于其球狀結(jié)構(gòu)，通常不易被TGase交聯(lián)，但經(jīng)熱處理時(shí)乳清蛋白變性，TGase可使其交聯(lián)[26]。RODRIGUEZNOGALES[9]研究表明，當(dāng)乳經(jīng)熱處理后，變性的α-乳白蛋白會(huì)與β-乳球蛋白形成復(fù)合物，然后再與κ-酪蛋白形成聚合物，TGase作用于κ-酪蛋白時(shí)，同時(shí)也穩(wěn)定了酪蛋白膠束，提高羊乳的熱穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

羊乳經(jīng)預(yù)熱處理后，用TGase對乳蛋白交聯(lián)，可顯著提高羊乳的熱穩(wěn)定性，羊乳中存在天然的TGase抑制劑，在60～70 ℃預(yù)熱處理60 min或80～90 ℃預(yù)熱處理30 min可使羊乳中TGase抑制劑完全失活，同時(shí)，預(yù)熱處理可使羊乳中乳清蛋白變性，促使乳蛋白的交聯(lián)，提高羊乳的熱穩(wěn)定性。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，預(yù)熱處理可促進(jìn)TGase與羊乳中κ-酪蛋白的交聯(lián)，使κ-酪蛋白在熱處理時(shí)不易從酪蛋白膠束表面解離，從而提高羊乳的熱穩(wěn)定性。