于卓然，洪厚勝，2*

1(南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京，211816) 2(南京匯科生物工程設(shè)備有限公司，江蘇 南京，210009)

Monacolin K(莫納可林 K)是紅曲菌的次級代謝產(chǎn)物。紅曲菌在我國有悠久的生產(chǎn)和應(yīng)用歷史，但一般僅用作天然色素、釀酒、制作腐乳以及中藥[1]。近年來，隨著生活水平的不斷提高，由高膽固醇所引起的冠心病、高血脂、腦血栓、前列腺癌等疾病已威脅著人類的健康，降脂類產(chǎn)品的需求日益增多，由紅曲菌天然發(fā)酵的以降膽固醇物質(zhì)莫納可林K為主要成分的功能性紅曲漸漸走進(jìn)人們的視野。研究表明，與從其他菌類提取或人工合成的洛伐他汀相比，紅曲產(chǎn)品中的莫納可林K結(jié)晶少、溶解度高，因而療效更顯著，毒副作用更小[2]。功能性紅曲中還含有γ-氨基丁酸、膽堿、麥角固醇、黃酮、不飽和脂肪酸等多種對人體有益的活性物質(zhì)[3]。由于紅曲固態(tài)發(fā)酵莫納可林K的產(chǎn)率遠(yuǎn)高于液態(tài)發(fā)酵，目前固態(tài)發(fā)酵仍然是功能性紅曲的常用生產(chǎn)方法，隨著國內(nèi)紅曲市場以及歐美和日本對我國紅曲產(chǎn)品的需求日益增大，如何有效提高功能性紅曲固態(tài)發(fā)酵莫納可林K的產(chǎn)量已成為紅曲發(fā)酵產(chǎn)業(yè)發(fā)展中必須解決的重要問題。

1 紅曲菌簡介

紅曲，古稱丹曲，是由紅曲菌科真菌紅曲菌的菌絲體寄生在大米上所制成的，既是食品，也是具有降血壓降血脂功能的傳統(tǒng)中藥[4]。我國對于紅曲的生產(chǎn)和應(yīng)用已經(jīng)有一千多年的歷史，最早始于唐代，在明代李時珍的《本草綱目》、宋應(yīng)星的《天工開物》中，都詳細(xì)記載了紅曲的制作方法[5]。按照真菌學(xué)的分類方法，紅曲菌屬真菌界(Eumycophyta)、子囊菌門(Ascomycota)、真子囊菌綱(Euascomycetes)、散子囊菌目(Eurotiales)、紅曲菌科(Monascaceae)、紅曲菌屬(Monascus)[6-7]。紅曲菌主要由分生孢子、子囊孢子和菌絲體組成，菌絲分枝繁雜，且具有橫隔。菌落形態(tài)以在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上為例，菌絲生長初期為白色，成熟衰老后漸漸變?yōu)榈t色或紫紅色等，因不同品種而異，菌落結(jié)構(gòu)呈絨氈狀或皮膜狀[8]。

2 紅曲的降膽固醇活性物質(zhì)莫納可林K

1979年遠(yuǎn)藤章教授[9]從紅曲菌的次級代謝產(chǎn)物中提取了一種可有效抑制膽固醇合成的活性物質(zhì)，并命名為莫納可林K。1980年美國學(xué)者ALBERTS[10]在土曲霉中發(fā)現(xiàn)了同樣具有抑制膽固醇作用的活性物質(zhì)mevinolin，后被稱作洛伐他汀(lovastatin)。后經(jīng)研究證明，二者為結(jié)構(gòu)相同的同一種物質(zhì)。此后科學(xué)界又從紅曲菌的代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了多種莫納可林類物質(zhì)，包括Monacolin J、Monacolin L、Monacolin M、Monacolin X以及最近由ZHANG等[11]發(fā)現(xiàn)的新型莫納可林類似物Monacolin T、Monacolin U、6a-O-methyl-4,6-dihydromonacolin L、6a-O-ethyl-4,6-dihydromonacolin L等，而這些物質(zhì)都需要轉(zhuǎn)化為莫納可林K才能夠?qū)δ懝檀嫉暮铣善鹨种谱饔谩?/p>

莫納可林K以酸式和內(nèi)酯式兩種結(jié)構(gòu)形式存在，酸式莫納可林K的結(jié)構(gòu)與人體內(nèi)膽固醇合成途徑中的HMG-CoA的結(jié)構(gòu)相似，能與限速酶HMG-CoA形成競爭性抑制，從而抑制膽固醇的合成[12]。內(nèi)酯式莫納可林K則需要被人體內(nèi)的羧基酯酶轉(zhuǎn)化為酸式結(jié)構(gòu)，才能夠發(fā)揮降膽固醇的作用[13]。

3 紅曲菌發(fā)酵莫納可林K產(chǎn)量的控制策略

選育高產(chǎn)莫納可林K菌種、優(yōu)化培養(yǎng)基、控制環(huán)境因子都是提高紅曲菌發(fā)酵莫納可林K產(chǎn)量的傳統(tǒng)方法，這些方法與紅曲固態(tài)發(fā)酵工藝過程緊密相關(guān)，效果顯著，實(shí)施簡單且成本較低，也是目前提高莫納可林K產(chǎn)量策略的主要研究方向。對于莫納可林K代謝途徑的控制，則是從分子水平上控制莫納可林K的合成，是高產(chǎn)莫納可林K研究的新熱點(diǎn)，但是對于基因改造菌株的安全性評估仍然難以實(shí)現(xiàn)，還需要更進(jìn)一步的研究[14-15]。

3.1 高產(chǎn)Monacolin K菌株的選育

近年來國內(nèi)外對于高產(chǎn)莫納可林K紅曲菌菌種的選育進(jìn)行了大量研究。常聰[16]等通過紫外-氯化鋰復(fù)合誘變法對紅曲菌菌株進(jìn)行了誘變，篩選出高產(chǎn)莫納可林K和紅曲色素的紅曲菌菌株QH12，其莫納可林K的產(chǎn)率為原始菌株的4.67倍，達(dá)到了1.68 mg/g，但是仍未達(dá)到《中國藥典》規(guī)定的紅曲質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。劉穎等[17]從不同的紅曲產(chǎn)品中分離純化出了96株紅曲菌菌株，并通過分子生物學(xué)手段篩選出1株高產(chǎn)莫納可林K的紅曲菌株NW3-2，固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中酸式莫納可林K含量為3.20 mg/g，內(nèi)酯式莫納可林K含量為2.47 mg/g，此菌株的莫納可林K產(chǎn)量較高，但其中無法直接利用的內(nèi)酯式莫納可林K所占比例較高，可進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵工藝提高酸式莫納可林K的含量。郎天丹等[18]利用正負(fù)電子對撞機(jī)的E2束流線打靶技術(shù)誘變選育出兩株高產(chǎn)莫納可林K的紫色紅曲菌株M1-20和M2-4，其原理是利用正負(fù)電子對撞機(jī)的E2束流線打靶產(chǎn)生的高能混合粒子場對菌株進(jìn)行輻照，進(jìn)而使菌株發(fā)生突變。祁田甜等[19]通過常壓室溫等離子體誘變技術(shù)選育出突變紫色紅曲菌株23，其莫納可林K的產(chǎn)量達(dá)到了428.14 mg/L，較初始菌株提高了111%。雖然選育高產(chǎn)莫納可林K的菌株可以從源頭上提高紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)莫納可林K的產(chǎn)量，但是紅曲菌次級代謝產(chǎn)物中的主要有害物質(zhì)桔霉素與莫納可林K同屬于聚酮合酶途徑，在莫納可林K產(chǎn)量增加的同時常常也會導(dǎo)致桔霉素含量的增加，因此在選育高產(chǎn)莫納可林K菌株的同時也應(yīng)注意其桔霉素的產(chǎn)量。

3.2 優(yōu)化培養(yǎng)基

對于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化的傳統(tǒng)方法主要集中在發(fā)酵過程中的碳源、氮源、金屬鹽和前體物質(zhì)的優(yōu)化，陳慎等[20]通過單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面分析后得出外加營養(yǎng)成分為：甘油1.00%，蛋白胨3.10%，檸檬酸三鈉0.13%，此培養(yǎng)基發(fā)酵的莫納可林K產(chǎn)量可達(dá)2.87 mg/g，但是此類對于培養(yǎng)基成分含量的基礎(chǔ)優(yōu)化提高的莫納可林K產(chǎn)量往往不高。紅曲菌發(fā)酵基質(zhì)的研究是近年來研究的熱點(diǎn)，有些發(fā)酵基質(zhì)不僅可以提高功能性紅曲莫納可林K的產(chǎn)量，也為功能性紅曲發(fā)酵產(chǎn)品的多樣性提供了新思路。ZHANG等[21]使用不同谷物進(jìn)行了固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)小米作為培養(yǎng)基質(zhì)時,莫納可林K產(chǎn)量最高，其產(chǎn)量達(dá)到了7.12 mg/g，此外還對其他發(fā)酵條件以及外加碳源氮源等進(jìn)行了優(yōu)化，使小米培養(yǎng)基在最佳條件下莫納可林K產(chǎn)量達(dá)到了19.81 mg/g，極大地提高了莫納可林K的產(chǎn)量。SHARMIN等[22]研究發(fā)現(xiàn)，用褐海藻Saccharinajaponica作為發(fā)酵基質(zhì)，在最佳條件下莫納可林K產(chǎn)量可以達(dá)到13.98 mg/g，而且經(jīng)檢測發(fā)酵出的莫納可林K具有較高的熱穩(wěn)定性、SOD含量以及膽固醇抑制活性。盧穎等[23]用燕麥作為發(fā)酵基質(zhì)制成了燕麥紅曲，在最佳條件下得到的莫納可林K含量達(dá)到了15.00 mg/g，而且其中淀粉含量為零，這就使得燕麥紅曲可以作為糖尿病患者功能性食品。車鑫等[24]選擇了15種常見藥材分別加入到培養(yǎng)基中進(jìn)行試驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)陳皮粉、山楂粉、山楂汁、桑葉粉、丁香汁、黑胡椒汁、白芷粉的加入均對紅曲發(fā)酵產(chǎn)莫納可林K有促進(jìn)作用，其中添加陳皮粉發(fā)酵的紅曲效果最好，莫納可林K產(chǎn)量為2.118 mg/g，中藥成分作為發(fā)酵基質(zhì)的研究為進(jìn)一步提升傳統(tǒng)紅曲藥食兩用功能提供了新的思路。培養(yǎng)基的優(yōu)化，尤其是發(fā)酵基質(zhì)的研究有利于開發(fā)出更多的紅曲發(fā)酵產(chǎn)品，而且對于莫納可林K發(fā)酵產(chǎn)量和質(zhì)量的提高往往極其顯著，具有廣闊的研究前景。

3.3 改變環(huán)境因子

環(huán)境因子包括溫度、光照、pH值、發(fā)酵時間等，都能對紅曲菌發(fā)酵莫納可林K的產(chǎn)量產(chǎn)生影響，通過對這些工藝參數(shù)的控制與優(yōu)化也是提高莫納可林K產(chǎn)量的控制策略之一。溫度是微生物生長的一種基本環(huán)境因素，溫度可以影響真菌的生長和其次級代謝產(chǎn)物的生成，MASATOSHI等[25]研究表明，先以最適溫度30 ℃發(fā)酵紅曲，而后轉(zhuǎn)為20 ℃條件下變溫發(fā)酵的紅曲莫納可林K產(chǎn)量遠(yuǎn)高于一直以30 ℃恒溫發(fā)酵的紅曲，變溫發(fā)酵莫納可林K的含量是恒溫發(fā)酵的20倍，其原因是在低溫時紅曲菌經(jīng)變溫刺激由生長轉(zhuǎn)為穩(wěn)定期，次級代謝產(chǎn)物開始大量生成。光照作為自然界主要的環(huán)境因素，對于許多微生物次級代謝產(chǎn)物的生理合成都具有調(diào)節(jié)作用，研究表明，不同波長的光線能夠影響紅曲菌的次級代謝[26-27]。張杰[28]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黑暗條件下紅曲菌莫納可林K的產(chǎn)量是藍(lán)光照射條件下的2.3倍，相對于黑暗環(huán)境，藍(lán)光會抑制莫納可林K的生成。楊建等[29]對pH值在紅曲發(fā)酵產(chǎn)莫納可林K過程中的影響進(jìn)行了研究，研究發(fā)現(xiàn)在初始pH為6.5時，莫納可林K含量最大，從而確定最佳初始pH為6.5(自然水)，補(bǔ)水pH為5時，莫納可林K含量達(dá)到最大值13.36 mg/g。趙秀舉等[30]通過正交試驗(yàn)設(shè)計研究了高溫與低溫發(fā)酵時間對紅曲菌發(fā)酵莫納可林K的影響，并優(yōu)化了功能性紅曲菌的發(fā)酵條件，優(yōu)化條件為裝料量360 g/L，高溫35 ℃發(fā)酵5 d，低溫22 ℃發(fā)酵15 d莫納可林K產(chǎn)量可達(dá)24 mg/g。對環(huán)境因子的工藝優(yōu)化可以與高產(chǎn)菌種選育和培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)合，綜合多種策略提高莫納可林K的產(chǎn)量。

3.4 控制莫納可林K的代謝途徑

控制莫納可林K的代謝途徑是從分子水平上控制莫納可林K的代謝合成[31]。一方面是通過運(yùn)用蛋白組學(xué)和基因組學(xué)等方法分析莫納可林K的代謝途徑和合成相關(guān)基因，再通過基因改造或添加能夠使相關(guān)基因抑制表達(dá)或過表達(dá)的添加物，達(dá)到控制莫納可林K合成途徑的目的[32-33]。LIN等[34]以紅曲菌次級代謝產(chǎn)物莫納可林K生物合成相關(guān)基因中的mokE基因?yàn)槟康幕?，?gòu)建了mokE基因過表達(dá)紅曲菌菌株，經(jīng)測定有3株mokE基因表達(dá)量增加，與野生型紅曲菌莫納可林K的產(chǎn)量1.448 mg/g相比分別提高了49.2%、132.5%和188.5%，這說明mokE基因過表達(dá)能夠提高紅曲菌莫納可林K的產(chǎn)量，在對其孢子、菌絲掃描電鏡觀察后推測，mokE基因過表達(dá)可能是通過影響紅曲菌的孢子和菌絲體的生長從而影響次級代謝莫納可林K的產(chǎn)生。JING HUANG等[35]通過加入亞油酸使紅曲菌莫納可林K的產(chǎn)量增加了135%，原因是亞油酸通過cAMP-PKA信號通路上調(diào)mokA和mokH的基因轉(zhuǎn)錄水平，而mokA是莫納可林K合成途徑中聚酮化合物合成關(guān)鍵酶PKS酶的編碼基因，mokH是與紅曲菌次級代謝相關(guān)的Zn(II)2Cys6結(jié)合蛋白的編碼基因，亞油酸使得mokA和mokH的表達(dá)更加活躍從而增加了紅曲菌次級代謝產(chǎn)物莫納可林K的產(chǎn)量。ZHANG等[36]研究了谷氨酸對紅曲菌莫納可林K生物合成基因簇表達(dá)的影響，結(jié)果表明與原始培養(yǎng)基相比紅曲菌在谷氨酸培養(yǎng)基中莫納可林K的產(chǎn)量增加了3.5倍，通過電鏡觀察分析，谷氨酸使紅曲菌的菌絲體顯著增加，改變了紅曲菌菌絲的滲透性，從而增強(qiáng)了莫納可林K向細(xì)胞外的分泌。另一方面，谷氨酸還上調(diào)了莫納可林K合成途徑中mokB、mokC、mokD、mokE、mokF、mokG、mokH和mokI的表達(dá)水平，而且谷氨酸還可以產(chǎn)生莫納可林K合成的底物乙酰輔酶A，以上多方面原因使紅曲菌莫納可林K的產(chǎn)量得以提高。紅曲菌莫納可林K合成途徑中相關(guān)基因、基因簇的研究起步較晚，許多研究尚未透徹，但上述研究為從分子水平上控制紅曲菌莫納可林K的代謝合成提供了新思路，應(yīng)作為今后莫納可林K控制策略研究的重點(diǎn)領(lǐng)域。

4 展望

目前，《中國藥典》2015年版已經(jīng)對功能性紅曲中莫納可林K的含量與測定方法做出了明確規(guī)定[37]，且歐美許多國家對于功能性紅曲產(chǎn)品進(jìn)口質(zhì)量和需求越來越大，檢測方法也越來越嚴(yán)格[38]，這使得我國功能性紅曲產(chǎn)業(yè)面臨著新的挑戰(zhàn)。

國內(nèi)外科研人員已經(jīng)從菌種選育、培養(yǎng)基優(yōu)化、環(huán)境因子控制和代謝途徑控制等方面研究提高紅曲菌及其發(fā)酵產(chǎn)品中莫納可林K的含量。今后對于莫納可林K的控制一方面應(yīng)該運(yùn)用分子生物學(xué)方法研究分析出紅曲菌莫納可林K合成和降解的相關(guān)基因與途徑，通過促進(jìn)合成或阻斷降解提高莫納可林K的產(chǎn)量；另一方面現(xiàn)階段國內(nèi)功能性紅曲工廠的生產(chǎn)工藝大多還處于塑料瓶發(fā)酵階段，發(fā)酵周期長、產(chǎn)量低、人工成本高等問題制約著我國功能性紅曲產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，許多研究成果由于操作困難、環(huán)境限制或成本昂貴難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，因此除了要繼續(xù)深入對紅曲莫納可林K產(chǎn)量控制的研究以外，對于功能性紅曲發(fā)酵設(shè)備的研究已刻不容緩，只有實(shí)現(xiàn)了功能性紅曲產(chǎn)業(yè)的機(jī)械化、自動化，才能更好地將紅曲莫納可林K產(chǎn)量控制策略的研究成果應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中。