陳曉宇， 陸利霞,2*，熊雄，劉元建,熊曉輝,2

1(南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京，210009) 2(江蘇省食品安全快速檢測公共技術(shù)服務(wù)中心，江蘇 南京，210009)

人體蛋白質(zhì)和微量元素的重要來源為肉及其制品。近年來，隨著人們生活和消費(fèi)水平的提高，肉類的權(quán)重在飲食中逐年增加[1]。但全球的肉制品安全現(xiàn)狀令人擔(dān)憂，歐洲的馬肉風(fēng)波[2]，我國江蘇地區(qū)羊肉摻假事件[3]等嚴(yán)重的食品安全問題不斷暴露。國內(nèi)部分地區(qū)開展肉及其制品的摻假情況調(diào)查[4]，2013年的結(jié)果顯示，25.6%的樣品標(biāo)識的源性成分與標(biāo)簽內(nèi)容不符，肉制品摻假問題嚴(yán)重，熟制牛肉和羊肉卷成為摻假高危品。另外由于通過食用牛源性成分的食品可能引起瘋牛病傳播[5]，以及宗教信仰問題，印度教徒不食用牛肉，而猶太和穆斯林人群飲食避免豬肉和馬肉成分[6]。在這樣的背景下，迫切需要建立針對食品基質(zhì)的快速、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確有效的肉源性鑒定的方法。

追溯到20世紀(jì)80年代，動物源性成分的鑒別已經(jīng)引起國外人士的重視，并開展了相關(guān)研究。目前鑒別方法有通過感官的(配合儀器)物理法、化學(xué)法，基于蛋白質(zhì)的免疫分析法、分子生物學(xué)法，如色譜法、酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法[7-8]、結(jié)合電泳的普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)法[9]、實(shí)時熒光PCR法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)[10-12]等。其中PCR方法最為準(zhǔn)確，快速，靈敏，尤其實(shí)時熒光PCR法，操作簡單，PCR產(chǎn)物不需要電泳，污染小，在食品檢測中應(yīng)用廣泛[13-20]，但是考慮熒光PCR儀器昂貴，對實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求高，本研究采用普通PCR方法進(jìn)行，選擇新標(biāo)識性基因位點(diǎn)，在保證結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定性高的前提下，可提高檢測靈敏度，極大節(jié)約了實(shí)驗(yàn)設(shè)備、熒光試劑費(fèi)用，檢測成本低廉，為牛肉及其制品的摻假檢測提供方法保障。

1 材料與方法

1.1 食品樣品

牛(Bovidae)樣本生鮮肉分別來自江蘇省南京市當(dāng)?shù)卮笮统?、大型菜市場，部分生鮮牛肉及其制品購自大型連鎖餐飲店或通過網(wǎng)絡(luò)渠道獲得。收集到的24個樣本信息詳見表1。其中生鮮牛肉是直接購買的未切分的產(chǎn)品，加工制品的配料來源于產(chǎn)品標(biāo)簽標(biāo)識。

同時市售購買牛近源哺乳動物肉類樣品，山羊(Caprahircus)、綿羊(Ovisaries)、馬(Equuscaballus)、驢(Equusasinus)、兔(Leporidae)、豬(Susdomesticus)及禽類雞(Gallusdomesticus)、鴨(Anatinae)、鵝(Ansercygnoidesorientalis)，其他常見動物草魚(Ctenopharyngodonidellus)、鯽魚(Carassiusaurtus)、小黃魚(Larimichthyspolyactis)，常見植物材料大豆(Glycinemax)、玉米(Zeamays)種子顆粒，用于建立的牛成分方法的特異性驗(yàn)證。

表1 收集到的24個樣本信息Table 1 Species information of 24 Bovidae samples collected for the study

實(shí)驗(yàn)樣品除驢肉、兔肉、鵝肉購自河南省外，其他樣本均購自南京市各大超市或大型農(nóng)貿(mào)市場，包括生鮮山羊、綿羊、馬、豬、雞、鴨、魚肉、大豆、玉米，生鮮牛肉片、牛肉卷、冷凍牛肉丸及牛肉卷，肉脯類(牛肉片、牛肉粒)加工制品購自網(wǎng)絡(luò)暢銷商家，所有牛及其制品的樣本均標(biāo)注含有牛成分或?yàn)榕Ｈ庵破?，其他樣本均需通過國家現(xiàn)行有效的標(biāo)準(zhǔn)方法[21-28]鑒定其源性真實(shí)。.

1.2 試劑與儀器

TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；10×Reaction Buffer、BioReady rTaq、dNTP Mixture，杭州博日技術(shù)有限公司；GelRedTMNucleic Acid Gel Stain，10 000×上海開放生物科技有限公司；DL500 DNA Marker、6×Loading Buffer，寶生物工程(大連)有限公司；PCR上下游引物合成，上海生工生物有限公司。

Life Express Thermal Cycler PCR儀，杭州博日技術(shù)有限公司；Biophotometer D30核酸蛋白測定儀，德國Eppendorf公司；JY300C電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；WD-9413B凝膠成像分析儀，北京六一生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣本的預(yù)處理

對于生鮮的肉樣品，用無菌、擦拭干凈的手術(shù)剪刀除去表層組織及肉皮、筋、脂肪層等，從內(nèi)部剪取肉塊(避免表層污染)，于高速粉碎機(jī)碾拌成均勻肉漿；對于植物樣品，于高速粉碎機(jī)研磨成均勻的粉末，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 靈敏度測試樣品制備

肉含量靈敏度試驗(yàn)擬定4種食品基質(zhì)(豬肉、羊肉、驢肉、大豆)與黃牛肉制備混合樣品[29]。考慮大豆為干粉，制備大豆以及牛肉混合樣品時，首先將牛肉、大豆粉真空40 ℃干燥，后用高速粉碎機(jī)將牛肉研磨成均勻的干粉。之后按照質(zhì)量梯度配制混合樣品，總質(zhì)量為100.00 g。將黃牛肉分別與大豆、豬肉、羊肉、驢肉混合，制備含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%牛肉的混合樣品，依次分別記為b1～b6、p1～p6、s1～s6、d1～d6，并將混合樣品均分為2份，1份不做處理，另1份模擬深加工產(chǎn)品進(jìn)行121 ℃、0.1 MPa，20 min高溫處理[15]， -20 ℃貯存待用。

1.3.3 DNA提取及確證方法

準(zhǔn)確稱取植物組織(種子部分)100 mg，動物組織或?qū)嶋H樣品25 mg，按照DNA提取試劑盒說明書步驟提取動植物組織DNA，每個樣品設(shè)置3個平行用于提取DNA，同時設(shè)置提取空白，并于核酸蛋白儀測定所提取DNA的濃度及純度，后-20 ℃保存待用。本研究使用的DNA濃度范圍60～800 ng/μL，純度(A260nm/A280nm)1.70～2.15、(A260nm/A230nm)1.87～2.40。提取的DNA在PCR擴(kuò)增之前，均采用1.2%的瓊脂糖，100 V電壓參數(shù)下50 min瓊脂糖凝膠電泳確證長度有效，滿足PCR擴(kuò)增要求。

1.3.4 引物設(shè)計(jì)

選取牛種屬線粒體細(xì)胞色素b(cytochrome b，Cytb)基因作為靶標(biāo)基因，以牛種屬中水牛(Bubalus)、黃牛(Bostaurus)、牦牛(Bosgrunniens)以及非牛動物(包括山羊、綿羊、馬、豬、雞、鴨、魚、鵝、驢、兔)的拉丁學(xué)名為關(guān)鍵詞，在NCBI上搜集Cytb基因序列，通過同源性比對分析[30]，確定參考基因序列的GenBank登錄號，并根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則完成引物設(shè)計(jì)。所設(shè)計(jì)引物的特異性通過BLAST驗(yàn)證，并委托生工生物工程有限公司合成。

1.3.5 PCR反應(yīng)體系及條件

反應(yīng)體系(25 μL)：2.5 μL 10×Reaction Buffer、1.0 μL dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)、0.3 μL(2U) BioReady rTaq，0.5 μL上游引物(10 μmol/L)、0.5 μL下游引物(10 μmol/L)、5 μL Template DNA、超純水補(bǔ)足至25 μL。

18S rRNA PCR反應(yīng)條件：模板預(yù)變性94 ℃，2 min；模板變性94 ℃，45 s,退火57 ℃，45 s,延伸72 ℃，45 s，30個循環(huán)；72 ℃，5 min。

Cytb PCR反應(yīng)條件：模板預(yù)變性94 ℃，2 min；模板變性94 ℃，45 s，退火57 ℃，45 s，延伸72 ℃，45 s，30個循環(huán)；72 ℃，5 min。

1.3.6 PCR產(chǎn)物檢測方法

取7 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與1.5 μL 6×Loading buffer混合，于1.5%瓊脂糖凝膠和0.5×TBE緩沖液中電泳(電壓160 V，30 min)，并采用凝膠成像分析儀查看拍照。

1.3.7 PCR產(chǎn)物測序

采用上述設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物取7 μL用于凝膠電泳，得到陽性擴(kuò)增條帶后，取剩余的PCR產(chǎn)物40 μL送上海生工生物有限公司測序部進(jìn)行測序。

1.3.8 引物特異性和靈敏度分析

特異性檢測選用3種牛品種；4種不同產(chǎn)地的近源哺乳動物： 1種反芻動物(羊)、3種非反芻哺乳動物(豬、馬、驢)；3種常見的禽類(雞、鴨、鵝)以及兔、魚；2種植物(大豆、玉米)樣品的DNA為模板，采用所建立的鑒定方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時設(shè)置空白組。

靈敏度檢測包括肉含量和DNA用量。肉含量靈敏度檢測的樣品處理和制備方法參照1.3.1。DNA用量的靈敏度檢測選擇黃牛和羊、馬、豬、雞、鴨、魚、鵝、驢、兔、大豆、玉米，分別將提取到的DNA稀釋到10 ng/μL，然后按照體積梯度，將黃牛DNA分別與上述非牛動植物DNA混合至黃牛DNA為體積分?jǐn)?shù)5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%，進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，以測試該方法的最低檢測限(limit of detection，LOD)。采用GB/T 25165—2010標(biāo)準(zhǔn)[31]，稀釋陽性DNA質(zhì)量濃度分別為：100、10、1.0、0.1、0.01、0.001 ng/μL，建立PCR方法標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定所建立方法檢測下限的DNA量。

1.3.9 方法適用性評價

采用所建立的方法，對市售的配料中含“牛肉”的26份樣品進(jìn)行檢測。每種樣品取2份，提取DNA后用18S rRNA引物驗(yàn)證所提取DNA的有效性，避免假陰性結(jié)果。18S rRNA引物擴(kuò)增陽性后，采用所建立的方法PCR擴(kuò)增。每個樣品做3個平行，減少隨機(jī)誤差。

同時采用GB/T 25165—2010[31]和GB/T 20190—2006[21]標(biāo)準(zhǔn)方法檢測上述26份樣品的牛源性成分，比較所建立的牛源性PCR鑒定方法與標(biāo)準(zhǔn)方法的一致性。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物設(shè)計(jì)結(jié)果

通過比對分析，確定參考基因序列的GenBank登錄號為：牛(KX575711.1)，綿羊(AF010406.1)[14]，馬(JF010406.1)、驢(JF718884.1)、兔(AJ001588)、豬(X56295.1)及禽類雞(X52391.1)、鴨(EU755252.1)、鵝(AY427816.1)等。最終選擇以牛的Cytb基因?yàn)榘谢?，確定GenBank登錄號為GU249568.1的序列為參考序列設(shè)計(jì)引物。采用Primer 5.0共設(shè)計(jì)了9對引物，結(jié)果如表2所示。將各組引物的預(yù)期序列與上述參考的非?；蛐蛄?綿羊、馬、驢、兔、豬、雞、鴨、鵝)進(jìn)行比對，選取引物3’端與牛源序列高度匹配而同非牛源序列不互補(bǔ)的1對引物，如圖1所示。結(jié)合后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終確定的引物及參考的真核生物18S rRNA引物(如表3)。

表2 本研究設(shè)計(jì)PCR引物Table 2 PCR primer used in this study

圖1 牛源性成分檢測引物KX187/207F和KX303/325
擴(kuò)增片段與其他物種線粒體DNA相應(yīng)片段一致性比對
Fig.1 Identity comparison sequences amplified by cow
specific primers(KX187/207F and KX303/325R) and
corresponding region of mtDNA of other animals

2.2 引物特異性分析

本實(shí)驗(yàn)中用到的動物源DNA均已采用現(xiàn)行有效的標(biāo)準(zhǔn)方法驗(yàn)證其源性真實(shí)，排除異質(zhì)污染，為特異性試驗(yàn)作保障。

為了驗(yàn)證引物對牛源性成分的特異性，將3種牛品種，9種非牛動物(羊、豬、馬、驢、兔、雞、鴨、鵝、魚)，2種植物(大豆、玉米)樣品的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果如圖2所示，牛樣品有明顯的擴(kuò)增條帶，長度為139 bp，與引物設(shè)計(jì)預(yù)期一致，其他11種非牛動植物均無擴(kuò)增條帶(如圖2-A)。研究中同時對選用的所有樣品采用18S rRNA引物擴(kuò)增，均出現(xiàn)目標(biāo)條帶并對應(yīng)其長度為119 bp(如圖2-B)。確證所提取DNA滿足PCR要求，避免假陰性結(jié)果。綜上，該對引物針對牛源性成分特異性良好。

表3 牛種屬及真核生物的寡核苷酸引物Table 3 Oligonucleotide primers for eukaryotes and cow species

A-采用特異性引物擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果；B-采用18S rRNA引物擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果；M-500 bp Maker；1～15依次為牦牛、黃牛、水牛、羊、雞、鴨、豬、驢、馬、兔、鵝、魚、玉米、大豆、空白對照圖2 普通PCR方法的特異性分析Fig.2 Specificity of the conventional PCR method

2.3 設(shè)計(jì)引物PCR產(chǎn)物測序結(jié)果

對所設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增獲得的陽性結(jié)果進(jìn)行核苷酸序列分析，結(jié)果如表4所示。表4中測序片段序列是通過對正、反向測序結(jié)果進(jìn)行接拼而成的完整序列。結(jié)果表明，目標(biāo)基因正向測序結(jié)果與預(yù)期目的基因序列一致性為100%，反向測序結(jié)果與預(yù)期目的基因序列一致性為100%。在NCBI(national center forbiotechnology information(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上BLAST結(jié)果顯示，測序得到的核苷酸序列與引物設(shè)計(jì)所依據(jù)的牛(KX575711.1)片段100%同源。綜上，所設(shè)計(jì)的引物能達(dá)到擴(kuò)增預(yù)期目標(biāo)基因的目的。

表4 牛PCR產(chǎn)物預(yù)期序列及測序結(jié)果Table 4 PCR products expected sequence and sequencing results

2.4 所設(shè)計(jì)引物靈敏度分析

2.4.1 肉含量

肉含量為相對靈敏度檢測，將黃牛肉樣品按照肉的含量梯度混入反芻動物基質(zhì)(羊肉)、非反芻哺乳動物(豬、驢)、植物基質(zhì)(大豆粉)中，分析可以穩(wěn)定擴(kuò)增的最低肉含量。根據(jù)GMO實(shí)驗(yàn)室歐洲網(wǎng)絡(luò)指南[33]，LOD值被定義為當(dāng)至少總重復(fù)的95%PCR結(jié)果中獲得陽性信號時，目標(biāo)肉含量的最低濃度。本試驗(yàn)中LOD使用9次實(shí)驗(yàn)重復(fù)分析，每個樣品同次設(shè)置3個PCR平行反應(yīng)。肉含量(生鮮)檢測限測試結(jié)果如圖3所示。

M-500 bp Maker；1-100%黃牛；2～7依次為黃牛肉含量梯度5%，1%，0.5%，0.1%，0.05%，0.01%；8-陰性對照；9-空白對照；A～D依次為黃牛肉混合羊肉、驢肉、豬肉、大豆粉的電泳結(jié)果圖3 肉含量檢測限測試結(jié)果Fig.3 The limit of detection test results of meat content

從圖3可以看出，黃牛肉混合羊肉、驢肉、豬肉、大豆粉的樣品(生鮮)的檢測限均為牛肉含量0.01%，27次PCR結(jié)果顯示，大于總重復(fù)95%的PCR結(jié)果顯示可檢測到的最低牛含量為0.01%；121 ℃、0.1 MPa，20 min處理的混合樣品，仍有高于總重復(fù)95%的PCR結(jié)果顯示,可檢測到牛肉含量達(dá)0.01%(結(jié)果未展示)。綜上，所建立的牛源性成分特異性檢測PCR方法的肉含量檢測限可達(dá)0.01%。

2.4.2 DNA用量

DNA用量的靈敏度為絕對靈敏度測試，選擇黃牛和羊、馬、豬、雞、鴨、魚、鵝、驢、兔、大豆、玉米，將黃牛DNA按照體積梯度與其他非牛動植物DNA混合，分析可以穩(wěn)定擴(kuò)增的DNA用量稀釋倍數(shù)。根據(jù)GMO實(shí)驗(yàn)室歐洲網(wǎng)絡(luò)指南[33]中對LOD的定義，DNA用量的LOD值使用9次重復(fù)分析確定，每個樣品同次設(shè)置3個PCR平行反應(yīng)。檢測結(jié)果見圖4。

如圖4所示，黃牛DNA摻入羊、雞、豬、兔、鵝、玉米、大豆DNA的檢測限均為DNA用量0.01%(總DNA量50 ng),黃牛DNA摻入鴨、驢、馬、魚DNA的檢測限均為DNA用量0.05%，27次PCR結(jié)果顯示，大于總重復(fù)95%的PCR結(jié)果顯示可檢測到的最低牛含量為總DNA的0.01%(結(jié)果未展示)。綜上，所建立的特異性牛源檢測PCR方法的DNA用量檢測限可達(dá)0.01%。采用GB/T 25165—2010標(biāo)準(zhǔn)[31]，按照1.3.7進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作(標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5)，通過30次PCR重復(fù)反應(yīng)，得到所建立PCR方法可穩(wěn)定檢測的牛DNA用量為0.2 pg。

M-500bp Maker；1-100%牛；2～7依次為黃牛DNA體積梯度5%，1%，0.5%，0.1%，0.05%，0.01%；8-陰性對照；9-空白對照；A～K依次為黃牛DNA混合羊、雞、鴨、豬、驢、馬、兔、鵝、魚、玉米、大豆DNA擴(kuò)增后的電泳結(jié)果圖4 DNA用量檢測限測試結(jié)果Fig.4 The limit of detection test results of DNA content

圖5 黃牛DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線
Fig.5 The standard curve line of cattle DNA

2.5 適用性評價

將26份市場上購買的標(biāo)簽中含“牛肉”成分的樣品分別編號1～26，并進(jìn)行檢測，結(jié)果如表5。

分析表5結(jié)果，表明采用所設(shè)計(jì)的特異引物鑒定樣品牛源性成分，均可擴(kuò)增出目的條帶；同時采用標(biāo)準(zhǔn)方法[31]比對，同所設(shè)計(jì)方法的結(jié)果一致率100%。表明所建立的特異性牛源成分鑒定方法適用性良好。其中22號樣品，采用所建立方法與標(biāo)準(zhǔn)方法[31]均未檢測出牛成分(同時以黃牛DNA為陽性對照)，表明市場上存在食品成分與標(biāo)簽不符或摻假的問題。所檢測26份樣品的18S rRNA引物擴(kuò)增結(jié)果均為陽性(結(jié)果未展示)，驗(yàn)證所提取的DNA滿足PCR擴(kuò)增要求。

表5 市售樣品PCR檢測結(jié)果Table 5 The results of PCR detection of commercialsamples

注：表中結(jié)果Ⅰ,采用本研究所建立的方法；結(jié)果Ⅱ,采用GB/T 25165—2010標(biāo)準(zhǔn)方法[31];+,檢出牛成分；—,未檢出牛成分。

3 討論

比較本研究建立的特異性牛源成分檢測方法，目前標(biāo)準(zhǔn)GB/T 20190—2006[21]選擇ATPase subunit 6&8基因設(shè)計(jì)引物的普通PCR牛成分檢測方法，得到牛成分的最低檢測限達(dá)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%；按照GB/T 25165—2010[31]，選取生長激素基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)的熒光定量PCR方法，檢測限達(dá)0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))；NANAS PASCOAL[34]、JEOMG CHUL HA[35]針對Cytb和12S rRNA建立牛源測試方法，檢測限分別可達(dá)0.025%、0.01%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))；ZHANG等[36]選用非內(nèi)部重復(fù)的、含有至少3個不同牛家族成員的1.709衛(wèi)星DNA作為靶基因，設(shè)計(jì)牛源成分引物，檢測限達(dá)33.6 fg DNA(生肉)、0.32 pg DNA(加工)。本研究建立的方法檢測限達(dá)0.2 pg DNA，0.01%牛肉含量，檢測限低于所述普通PCR方法，與現(xiàn)有的實(shí)時熒光PCR方法的檢測限相當(dāng)，達(dá)到了熒光PCR的高靈敏度，同時極大地降低了檢測成本。因此所建立的牛源成分鑒定方法達(dá)到了高特異性、高靈敏性的要求，具有成本低的優(yōu)勢。

本研究從GenBank中檢索獲得不同牛種屬的線粒體色素b(Cytb)基因，與其他畜類、植物等進(jìn)行同源性分析比對后，選擇了新標(biāo)識性基因位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了引物，建立了高效新標(biāo)識基因位點(diǎn)的擴(kuò)增體系。所選取的Cytb基因種內(nèi)高度保守，種間高度特異，進(jìn)而提高了檢測方法的靈敏性、穩(wěn)定性和適用性。